遗传测序仪介绍

1、3500/xl遗传测序仪介绍,肖怀东 Field Application Scientist Tel: 400 820 8982 / 800 820 8982 E-mail: CNAPM,AB遗传分析仪发展历史,3500 , 3500（xl）,1986年 370型全世界第一台基因分析仪 1991年 373型基因分析仪 1995年 377 型基因分析仪，光栅+CCD 1996年 310型毛细管基因分析仪,全世界第一台毛细管分析仪 1997年 377-96基因分析仪 1998年 3700型96道毛细管基因分析仪 2000年 3100 16道毛细管基因分析仪 2002年 3100 Avant 4道毛

2、细管基因分析仪 2002年 3730 48道毛细管基因分析仪 3730 xl 96道毛细管基因分析仪 2004年 3130 4道毛细管基因分析仪 3130 xl 16道毛细管基因分析仪 2007年10月 新一代超高通量序列分析仪SOLID 2009年 3500系列毛细管基因分析仪 2010年 第三代测序仪Ion Torrent,主要内容,测序仪工作原理 仪器的结构及DC软件应用,测序仪工作原理,电进样 DNA在碱性环境下带负电荷 带负电荷的DNA在强电场作用下进入毛细管,15 kv,仪器工作原理电进样,TRIVIA:电进样意味着什么?,只有带电分子能够进入毛细管.,+,仪器工作原理-通过毛细管

3、电泳分离DNA片段,负极,正极,TRIVIA: 什么样的片段泳动的更快?,-,仪器能够区分带电的DNA和其他带电分子吗?,小片段,不,仪器工作原理 -荧光标记的DNA片段在检测窗口被检测,双向激发,仪器工作原理 -激发出的荧光由于波长不同而被分离，并被CCD相机收集,TRIVIA: 什么是CCD?,Charged Coupled Device电荷耦合器件,CCD 相机收集波长范围520nm到650nm（发射波长） 虚拟的光栅设置 氩离子激光，激发波长488nm，514nm.,仪器工作原理,荧光标记的DNA在电场中由负极向正极移动,依次通过激光检测区,小片段在前,大片段在后 激光束在检测窗口同时

4、激发16/4根毛细管,荧光分子被激发,产生荧光信号 发射的荧光信号被CCD相机收集 软件将光学信号转化为电信号,Laser,CCD,毛细管空间定位(Spatial Calibration),什么是空间定位？ 空间定位将标记出每道毛细管在CCD上的对应位置，使信号收集软件(Data Collection)能够找到它们。,什么时候要做空间定位?,毛细管安装完成后,包括重新安装用过的旧毛细管 移动或调节了毛细管检测窗口的位置 仪器移动后 作为仪器日常维护的一部分,怎么做?,当仪器正常启动，毛细管已经安装在仪器上，仪器上的相应位置已经放置了胶、缓冲液和水； 进入Data Collection软件， 点

5、击窗口左边的Spatial Run Scheduler进入空间定位页面； 在左下角Protocol中选择一种运行模式，有不灌胶和灌胶两种模式,毛细管空间定位(Spatial Calibration),指标: 峰高大致相同 峰型尖锐、左右对称 橙色十字在峰顶端 间距:13 - 16,空间定位结果评估,Click to save the calibration data to the database,空间定位结果评估,Click for any failed calibration,空间定位结果评估,如果空间定位失败怎么办?,重复做一次空间定位 若无效，观察系统中有无气泡，去除气泡后再定位 若无

6、效，重新安装毛细管的检测窗口，进行空间定位 若无效，取下毛细管，用枪吸取无水甲醇冲洗毛细管检测窗口上的凹槽，待甲醇晾干后将毛细管装回，进行空间定位,空间定位结果评估,空间定位故障排除,让机器认识纯荧光。 每个染料都有自己的最大发射波长，但是不同染料之间有相互重叠的部分，重叠的部分通过光谱校正来识别。,光谱校准目的,光谱重叠,光谱校准目的,多重颜色检测,光谱校准目的,什么时候做? 使用新的染料组合 调整过仪器的光路系统 不同颜色的荧光间出现干扰(有拔起或下压峰) 参数改变(如毛细管长度改变) 作为每年一次的日常维护 怎么做? 按照试剂盒说明书配制Matrix,对于8道或者24道的仪器,分别加第一

7、个run的孔,每个孔加10l配置好的混合物. 在Data Collection窗口中操作,光谱校准,概要,仪器结构 仪器耗材 仪器开机 样品检测流程及DC软件介绍 仪器关机,电源 开关,自动进样器按纽,内部照明灯开关,状态灯,仪器结构外观,网络插口,断路开关,电源插头,宽度：61cm 深度：61cm 高度：72cm 重量：82kg,3500/3500 xl基因分析仪,3130/3130 xl基因分析仪,宽度：74cm 深度：54.8cm 高度：81cm 重量：130kg,总体积3500是3130系列的82% （减少了18%） 总重量3500是3130系列的63% （减少了37%）,仪器结构,通

8、量增加,特征/功能,低通量,高通量,中通量,最大样品处理数/天,方便性 应 用 可靠性 性 能,3730,3100,310,高,低,3130 xl,3130,48,96,384,1914,2676,3100Avant,192,762,1152,胶块区 (Gel block region）,检测区 (Detection region）,自动进样区(Autosampler region）,胶块区 (Gel block region）,胶袋,胶袋,毛细管阵列,炉子Oven,检测窗口,电极electrodes,自动进样器 Autosampler,阳极bufferABC,阴极buffer CBC,样品托

9、盘 Sample tray,风扇Fan,CBC 阴极缓冲液槽,ABC 阳极缓冲液槽,POP胶袋,毛细管阵列,仪器耗材,内壁无涂层 50 m 内径 160 runs,仪器耗材毛细管,仪器耗材毛细管,仪器耗材胶,保存在冰箱冷藏室的中央 使用前，放置在室温下 1 hour 在仪器上可放置1周 不同仪器之间的胶袋不要交换使用， 胶袋中的胶包括安装和安装后维护使用的部分，如排气泡. 过量的维护操作会影响到跑样品使用的数量,仪器耗材胶的保存,Pull Lever Down,Pull Lever Up,仪器耗材胶的安装,仪器耗材缓冲液,On instrument:,Two unique Septas,一体化

10、缓冲杯 迷宫般设计分离洗涤池和废液池 确保缓冲液达到Fill line 两种独立的胶垫Septa (available in CBC septa kit)，注意胶垫安装 注意缓冲液放置的位置 在仪器上放置有效期7天 存储在冰箱冷藏，使用前恢复室温,仪器耗材阴极缓冲液,预装好的1 x running buffer 1个包装4个 易于安装 放置在仪器上的有效使用期限为7天 安装前确保溢杯中的缓冲液都流到主腔中 确保主腔中的缓冲液达到Fill line 存储在冰箱冷藏，使用前使之恢复室温,Removable seal,Overflow chamber,仪器耗材阳极缓冲液,用途 填充胶泵 换胶时冲洗胶

11、泵使用 仪器长期关机时使用 可供一次使用，足量,仪器耗材Conditioning Reagent,耗材在仪器上的放置有效期,仪器开机,打开电脑，至Ctrl+Alt+Del界面 开启仪器，等待绿灯长亮 Ctrl+Alt+Del，点击Administrator，输入密码Administrator 电脑自动开启Daemon（DC2.0隐藏）和Server Monitor打开电脑 打开收集软件（ Data Collection ）,快捷操作键,耗材仪表盘耗材量和有效期,耗材详细信息,仪器运行状态及预热键,维护提示,仪器开机,样品检测流程,实验前准备：检查耗材和仪器 设置/导入板子 命名板子 编板，完成

12、信息选填 配制上样试剂和样品 链接样品盘 运行过程中的质控 Preview run Monitor run Review results,样品检测流程实验前准备,1. 准备仪器 耗材有没有过期 足够的buffer（在fill line上） 2. 预热炉温 3. 查看仪器状态 胶泵及通路中有没有气泡 有无胶泄漏和析出的残胶,样品检测流程创建电泳板,Plate Properties界面中给板命名,Plate Contents界面中完成板内信息,样品检测流程链接样品盘,样品检测流程核查和编辑进样顺序表,Injection Details,Sample Details,Raw Data Display

13、,样品检测流程实时监测,样品检测流程实时监测,样品检测流程查看电泳结果,View Fragement/HID Results,仪器校准在哪里找,空间定位,Perform QC Checks .,仪器校准空间定位,仪器校准空间定位结果,步骤： 配制光谱校正标准品：置于加样板第一个Run（非常重要！） 上机检测标准品：填写几个电泳参数 对结果接受or拒绝,仪器校准光谱校准,仪器校准光谱校准,仪器校准光谱校准结果,仪器校准光谱校准结果,Datacollection Software参数设置,参数设置Library是什么？,包括以下管理设置: Plates Assays File Naming Con

14、vention Results Group 不同的标志: 出厂设置不能编辑/不能删除 模板 锁定 可以基于出厂设置、模板和锁定的文件，点击 Duplicate, 编辑复制版then edit the copy,参数设置Library是什么？,预置了HID相关文件: Instrument Protocols Dye Sets Size Standards QC Protocols HID Analysis Protocols 用户可以自己创建对应的分析文件,参数设置Library是什么？,Result group library, Results Group Name Assay Name In

15、jection Number IP Name (instrument protocol) Logged-in User Name PA Protocol Name (primary analysis) Plate Name Prefix Start Instrument Run Date/time Stamp Suffix,如何创建Result Group,举例,Result Group Defaults Example 2,The factory-provided PN_RG results group creates a folder for all samples in a plate

16、If two plates are included in a run, a separate folder is created for each plate,Results Group Hierarchy,The folders and files generated by the results group, file name convention, run name, and injections shown below are outlined in the hierarchical fashion as it is set up in Data Collection The numbers in the figure relate the elements in the file name convention with the files created by a run that uses this file name convention,仪器关机,关闭收集