第8章-第1节-基因诊断(3-LMJ).ppt

1、第八章基因诊断和基因治疗，基因诊断：在基因层面检测和分析疾病的原因。gene therapy(基因治疗):纠正基因水平的干涉和疾病导致的障碍。1，大部分非感染性疾病的根本原因是基因结构的变异或表达水平的异常。感染性疾病是由病菌在体内表达外源性基因引起的。讲师：姜晨，1，0336032336040，2，1，基因诊断的概念和特性，2，基因诊断的主要技术方法，3，常见基因异常及其检测，4，疾病的基因诊断(自学)，5基因诊断一般使用分子生物学的方法技术在体内第一，基因诊断的概念和特征，(1)适用于遗传性疾病、感染性疾病、肿瘤等多种疾病的诊断，个人识别和亲子鉴定等法学领域的概念。03:32336040，

2、4，(2)特征以已知基因为检查对象，(L)特异性强：直接检测引起疾病的基因变化。(2)灵敏度高：使用的分子杂交和聚合酶链反应等技术都具有信号扩增效果。(3)促进抽样：通常不受组织或时间阶段的限制。(4)早期诊断：疾病还没有临床表现时容易诊断。(5)广泛使用：可以检测自身基因和外源基因。0:32336040，1，基因诊断的概念和特征，(1)核酸分子杂交(NA hybridization)，(2)聚合酶链式反应(SSCP)技术，(3)单链形态等位基因特异性寡核苷酸杂交(allele-specific oligo nucleotide hybridization，asoh)，0:32:40，2，基因

3、诊断的主要技术方法，7，1，便于大规模测试和筛选。容易产生假阳性。特性：7，03:32:40，Slot-blot blot结果，GS-670英寸光密度扫描仪(Bio-Rad)，9，2。组织现场交配，方法：应用：细胞内基因或mRNA的检测和定位。特征：无需提取被检核的核酸，就可以确认被检核的核酸细胞内的位置。1986年制造的荧光原位杂交(FISH)，用于特定基因的位置和缺失、扩增或重排检查。9，03:32:40，10，03:323:40，11，原癌基因ERB-2 (HER-2)，基因扩增荧光原位杂交检测，03:32:40根据已知基因突变位点的碱基序列野生方法：应用：诊断基因结构变异引起的疾病。特

4、点：杂交条件要严格，避免假阳性或假阴性发生。，03:32:40，14，N，N:正常基因；h:异型合子基因；M:突变基因，ASO1，ASO2，N，H，M，ASOH图表，0336032336040，15，4。DNA方法：应用：单核苷酸多态性(SNP)，基因表达谱和遗传性疾病分析；大规模检测病原微生物。DNA微阵列(DNA microarray)使用计算机控制点样本和通过图像扫描实现的高密度集成探针的混合技术。03:32:40，16，(2) PCR技术(第7章，共7章)，1。PCR技术的原理，如果多次重复此过程，DNA拷贝数可能会呈指数增长，具体取决于复制次数。03:32336040，2，基因诊断的

5、主要技术方法，17，2。基因诊断中常用的PCR及其衍生技术，(1) DNA的微量分析，总RNA(或MRNA) SS-CDNA DS-，(2)rt-PCR(rever setranscription al-)，18，03:32336040，19，(5)多个多倍PCR(multiplex PCR)，在同一反应系统中添加多对引物，同时放大同一DNA样本内的多个不同序列区域，每个引物对放大的产物长度不同。(6)设计了等位基因特异性PCR(AS-PCR)、等位基因序列差异区的诱集，对应于诱集物的第三段和等位基因序列的差异碱基，只能以突变型或野生型进行补充。19，0336032336040，20，(7)原

6、位PCR (in situ PCR，IS-PCR)技术，2)幻灯片目标DNA是现有病毒RNA扩增的RT-PCR，3)最后通过间接法(原地交配)或直接法(在PRC过程中添加标记)检测扩增产物。0:32336040，21，(8)实时荧光定量PCR，PCR放大时Taq酶的5- 3外体酶活性分解探针酶，使荧光基团和淬火荧光基团分离，使荧光监测系统接收荧光信号。DNA链每次扩增，都会形成荧光分子，荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。03:32336040，22，(3)单链结构多态性分析，单链或多碱不同，但使用序列长度相同的双链核酸分子转化为单链后，可以有不同的形态，中性页电泳中的迁移率不同。(SS

7、CP)，22，0:323:40，与一般电泳模式进行比较，可以确认出现了新的波段，出现了碱基变异。第二，基因诊断的主要技术方法，23，PCR-SSCP与PCR一起；称为。广泛用于大量样本基因突变检测(初级体)。03:32336040，24，1。限制性片段长度多态性检测，3 .单核苷酸多态性，2 .数可变序列重复序列多态性检测；(4)DNA分子多态性分析(variable number of tandem repeats，vntr)；(restriction fragment)；微卫星微卫星DNA(microsatellite DNA ):重复单元长度为16bp。，短连接冗馀短串联重复DNA(ST

8、R DNA):重复单元长度为26bp。这称为VNTR多态，因为根据重复单元的长度，对象之间重复单元的副本数(即发生频率)，例如25，0:32336040，26，(CA)n/(TG)n。VNTR多态性：限制酶识别站点限制酶识别站点，27，0:32336040，2，基因诊断的主要技术方法，28，-gaattc-cttaag-，ecor限制性内切酶部位的变化对石蜡包埋组织的回顾性，2 .染色体的显微切割。1 .组织细胞的显微切割是分裂中期切割染色体的目的领域。例如，切除部分断裂或错位，逆位点的染色体片段，进行后续分析。29，03:323:40，2，基因诊断的主要技术方法，30，瑞士MII CellC

9、ut全自动激光显微切割(荧光)系统可以通过紫外线激光切割必须分离的组织收集，然后通过粘性的Eppendorff盖子收集。03:32336040，31，正确、快速、无损伤地分离纯特定细胞或组织，为后续DNA、RNA和蛋白质分析维持细胞内生物分子的完整性。配备近红外激光(波长810纳米)。紫外线激光(波长349nm)；红、绿、蓝三种荧光滤镜。美国Arcturus的Veritas激光捕获显微镜分离器，03:323:40，PICSAltraII流式细胞系(分析分类)，32，0:32:40，33，(7) D缺点：时间，33，0:32336040，2，基因诊断的主要技术方法，34，(1)点突变检测，3，一

10、般基因异常及其检测，(2)大片段核苷酸丢失或插入检测，(3)基因重排检测广义点突变，1 .已知点突变检测，突变部位暴露的遗传病可以通过PCR等基因特异性寡核苷酸杂交(PCR/AS0H)检测出来。35，03:32:40，3，常规基因异常及其检测，36，PCR/AS0H检测：(1)根据突变点上游下游的序列设计合成引物，PCR放大突变区域的DNA片段。(2)将PCR产物用斑点或狭窄的缝隙取样器放入尼龙膜中，用紫外线固定。(3)对上述每个突变部位分别合成两个寡核苷酸探针。其中一个有正常的碱基序列，另一个有突变的碱基序列。(4)分别预交配、交配、洗衣膜、辐射本身现象或发色。(5)正常探针及突变探针分别分

11、析杂交显影或色谱，进行基因诊断。03:32:40，37，N，N:正常基因H:异型合子基因；m:突变基因，aso1，aso2，n，h，m，(PCR/as0h检测图)，0336032336040，03:32336040，40，3。某些核苷酸缺失或插入检查，可选方法：PCR-RFLP分析、AS-PCR、PCR-SSCP和DNA排序等；0:32333333333方法：设计一对引物PCR扩增时为294bp、Oxa、BP、结果：41，0:32:40，42、(2)大块的核苷酸丢失或插入检测，1。中等长度(0.5-，03:32336040，2)。如果基因大(大于1.5kb)，多个部位插入或缺失，且比特之间的距离很远，则必须使用多PCR方法进行检测。(多PCR的引物设计图)，3，一般基因异常和检测，43，DMD基因位于人类X染色体短臂Xp21.2。位于该地区的dystrophin基因的突变或部分缺失是DMD的发病原因。dystrophin基因中有9个容易遗漏的热点片段，分别位于埃克森4、8、12、17、19、44、45、48、51。Duchenne Muscular Dystrophy