六-RNA的转录-原核.ppt

1、真核与原核生物DNA复制的特点 真核生物是多点复制，原核生物是单点复制。 真核生物在完成全部复制之前，各个起始点上DNA的复制不能再开始；原核生物起始点上可连续开始新的DNA复制。 真核生物线性DNA末端具有端粒结构。,端粒的结构 是一段DNA序列和蛋白质形成的复合体，由多 个串联在一起的短寡核苷酸5-8bp序列组成。 5 /-（TxGy）n；3/-(AxCy)n； 其中x，y是碱基数，一般在1-4范围内。n是短 寡核苷酸序列的重复次数，可以多达数千次。 人的端粒DNA约5-15 kb。,端粒的功能 保证线性DNA的完整复制； 保护染色体末端不受核酸酶水解和不发 生染色体的异常重组；,体细胞端

2、粒酶活性低。随着复制次数的增加端粒DNA逐步缩短，细胞逐渐停止分裂，而进入凋亡。 恶性肿瘤细胞可表达端粒酶，永生分裂。,端粒DNA的合成 端粒酶(telomerase)是反转录酶由蛋白质和RNA两部分组成的，它以自身的RNA为模板，在随从链模板DNA的3OH末端延长DNA。 再以这种延长的DNA为模板，继续合成随从链形成端粒结构。,第六章 RNA的转录,引言,RNA的结构与种类 结构：ATPUTP GTPCTP 大分子结构：单链 双螺旋区 三叶草结构 种类：mRNA rRNA tRNA,Ribosome tructure,Signals for translation initiation,T

3、ranslation,转录是生物界RNA合成的主要方式，是遗传信息由DNA向RNA传递过程，也是基因表达的开始。转录也是一种酶促的核苷酸聚合过程，所需的酶叫做依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP）。转录产生初级转录物为RNA前体（RNA precursor），它们必须经过加工过程变为成熟的RNA，才能表现其生物活性。,6.1 RNA的转录概述,转录（transcription） ：以DNA为模板合成与模板DNA链序列互补的RNA单链的过程。 主要步骤：识别、起始、延伸、终止 模板识别：RNA聚合酶与启动子DNA作用并与之结合。在DNA形成转录泡。 通过启动子：转录起始后直到9个核苷酸短链 转录延

4、长： RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动并产生新RNA链伸长。 终止：不再形成磷酸二酯键，RNADNA分离，转录泡瓦解，DNA恢复双链。,DNA分子双链的划分： 编码链：不作复制模板的DNA单链，又称有义链或+链 模板链：作复制模板的DNA单链，又称反义链或-链,6.1.1 信使的发现,1955年Brachet用洋葱根尖和变形虫进行实验： 若加入RNA酶降解细胞中的RNA，则蛋白质合成就停止； 若再加入来自酵母的RNA，又可合成蛋白质。 这表明什么？,同年Goldstein和Plaut用同位素标记变形虫RNA前体 发现标记的RNA在核内。 标记追踪实验：用短脉冲标记RNA前体，然后将细胞核

5、转移到未标记的变形虫中，经过一段时间又发现被标记的RNA已在细胞质中。 这表明什么？,1956年E. Volkin和 L.Astrachan： 用同位素脉冲追踪标记 表明T2噬菌体新合成的RNA的碱基比和自身的DNA碱基比相似，而和细菌的碱基比不同。T2感染细菌时注入的是DNA，而在细胞里合成的是RNA。 这表明什么？,最令人信服的证据是Hall.B.D和Spiegeman,S的DNA-RNA的杂交实验： 将T2噬菌体感染E.coli后产生的RNA分离出来，分别与T2和E.coli的DNA进行分子杂交。 结果这种RNA只能和T2的DNA形成“杂种”链，而不能和E.coli的DNA进行杂交。,法

6、国科学家雅可布（F.Jacob）和莫诺（J. Monod）（1961）进行了一系列的的实验： 将E. coli培养在15N/13C的培养基中，因此合成的RNA和蛋白都被“重”同位素所标记。也就是说凡是“重”的核糖体，RNA和蛋白都是细菌的。 然后用T2感染E. coli，细菌的RNA停止合成，而开始合成T2的RNA。 此时用普通的“轻”培养基（14N/12C），但分别以32P来标记新合成的T2 RNA，以35S标记新合成的T2蛋白，因此任何重新合成的核糖体，RNA，及蛋白都是“轻”的但都带有放射性同位素。,经培养一段时间后破碎细胞，加入过量的轻的核糖体作对照，进行密度梯度离心。 结果“轻”的核

7、糖体上不具有放射性，“重”的核糖体上具有32P和35S，表明 （1）T2未合成核糖体，“轻”核糖体是后加放的。 （2）T2翻译时是借用了细菌原来合成的核糖体，所以核糖体并无特异性，核糖体上结合的mRNA，其序列的特异性才是指导合成蛋白质的遗传信息， 从而提出了mRNA作为“信使”的证据。,Jacob和Monod预言: （1）这种“ 信使”应是一个多核苷酸； （2）其分子平均不小于5105bp,足以携带一个基因的遗传信息； （3）它们至少是暂时连在核糖体上； （4）其碱基组成反映了DNA的序列； （5）它们能高速更新。 Jacob和Monod将它定名为: 信使RNA (Messenger RNA

8、) 或mRNA。,6. 1. 2 RNA合成的基本特点,1960年Weiss,S,B等发现RNA聚合酶(RNA Pol)。其特点是： （1）以核糖核苷三磷酸（rNTR）为底物； （2）以DNA为模板； （3）按5-3方向合成； （4）无需引物的存在能单独起始链的合成； （5）第一个引入的rNTP是以三磷酸形式存在； （6）催化磷酸二酯键形成，使RNA链延长,（7）在体内DNA双链中仅一条链作为模板，所以这种转录方式又叫做不对称转录； （8）RNA的序列和模板是互补的； （9）需要Mg2+或Mn2+离子； （10）RNA聚合酶缺乏35外切酶活性，所以没有校正功能。,确定有义链,1963 J. M

9、armur和Doty 以枯草杆菌的SP8噬菌体为材料的杂交实验，能区分DNA的两条链，从而证明了在体内DNA只有一条链被转录。 SP8的双链DNA很特殊，大多数的Pu分布于同一条链上，大部分Py分布于另一条链上，使两条链的“轻”，“重”差异明显。,显然，只有SP8的重链可作为其mRNA的模板。 现在人们将这条作为转录模板的DNA单链称为模板链或反义链（antisen strand），非模板链称为有义链（sense strand）或编码链。 在体外DNA的两条链都可作为RNA合成的模板。,mRNA的合成方向,无论是在体外还是在体内，mRNA的合成总是延着5-3方向进行的。 怎样用实验证实mRNA

10、的合成总是沿着53方向进行的？,E.coli在 0C时需13秒钟才能加上一个核苷酸，但在37C每秒就可加上40个核苷酸; 利用这个差别以14C来标记U,在0C培养E.coli。 提取这种正在伸长的mRNA分子,发现 14C标记首先出现在伸长的3端，因此可以证明合成是延着5-3方向进行的。,mRNA的合成方向,6.1.3 几个 基 本 概 念,转录(transcription):是指以DNA为模板，在依赖于DNA的RNA聚和酶催化下，以4种rNTP（ATP、CTP、GTP和UTP）为原料，合成RNA的过程。 在有些病毒中，RNA也可以指导合成RNA。 转录是基因表达的第一步，也是最关键的一步。,

11、反义链(antisense strand)：又称模板链template srand,指作为模板进行RNA转录的链,有义链 (sense strand) 又称编码链 coding strand:指不作模板的DNA单链。,从启动子 (promoter)到终止子(terminator)的转录区域称为转录单位 (transcription unit)。 原核生物的转录单位多为 polycistron in operon,真核生物中的转录单位多为monocistron, No operon。 转录起点即转录原点记为1，其上游记为负值，下游记为正值 。,6.1.4 RNA合成和DNA复制的区别,(1) 转

12、录时只有一条DNA链为模板，而复制时两条链都可作为模板； (2) DNA-RNA杂合双链不稳定，RNA合成后释放，而DNA复制叉形成后一直打开，子链和母链形成稳定的子代双链； (3) RNA合成不需引物,而DNA复制需引物； (4) 转录的底物是rNTP，复制的底物是dNTP； (5) 聚合酶系不同。,6.2 细菌基因的转录（原核）,6.2.1 细菌的RNA聚合酶 6.2.2 原核生物转录的起始延伸 6.2.3 原核生物转录的终止,6.2.1 细菌的RNA聚合酶,1. 全酶 (Holo Enzyme)和核心酶(Core Enzyme),6.2.1 Bacterial RNA polymeras

13、e,(1) 全酶（Holo Enzyme）,用于转录的起始和延伸 依靠空间结构与DNA模板结合 (:sigma 西格马与核心酶结合后引起的构象变化) 专一性地与DNA序列(启动子)结合 结合常数：1014mol 半衰期：数小时 至 1秒以下 转录效率低，速度缓慢（ 的结合 ）,6.2.1 Bacterial RNA polymerase,（2）核心酶（Core Enzyme）,作用于转录的延伸过程 依靠静电引力与DNA模板结合（蛋白质中碱性基团与DNA的磷酸根之间） 非专一性的结合（与DNA的序列无关） 结合常数：1011mol 半衰期：60秒,6.2.1 Bacterial RNA poly

14、merase,E.Coli RNApol 的亚基组成,6.2.1 Bacterial RNA polymerase,6.2.1 Bacterial RNA polymerase,core enzyme,（3）全酶的组装过程,此外，新发现的一种: omega omiga 欧米伽亚基的功能尚不清楚。,6.2.1 Bacterial RNA polymerase,2、各亚基的特点和功能,（1） 因子 因子可重复使用 修饰RNApol构型 使Holo Enzyme 识别启动子的Sextama Box(35区), 并通过与模板链结合,6.2.1 Bacterial RNA polymerase,不同的因

15、子识别不同的启动子 E. coli 中有四种因子(70、32、54、28) 枯草杆菌中有11种因子 （因子的更替对转录起始的调控）,6.2.1 Bacterial RNA polymerase,E.coli中不同的因子可识别不同的启动子,6.2.1 Bacterial RNA polymerase,E.coli不同的因子识别不同保守顺序的启动子,6.2.1 Bacterial RNA polymerase,（2）因子,核心酶的组建因子 促使RNApol 与DNA模板链结合 前端因子使模板DNA双链解链为单链 尾端因子使解链的单链DNA重新聚合为双链,6.2.1 Bacterial RNA po

16、lymerase,促进RNApolNTP RNA elongation 完成NMP之间的磷酸酯键的连接; Editing 功能 (排斥与模板链不互补的碱基); 与Rho （）: rho rou 肉因子竞争RNA 3end; 构成Holoenzyme 后,因子含有两个位点： I site (initiation site . Rifs): 该位点专一性地结合ATP或者GTP (需要高浓度的ATP或GTP); E site(elongation site RifR):该位点非专一性地结合NTP （催化作用和Editing功能）.,（3）因子,（4） 因子, 参与RNA非模板链（sense stra

17、nd）的结合 （充当SSB）,6.2.1 Bacterial RNA polymerase,6-1,E.Coli RNApol 各亚基作用位点,因子作用位点，与启动子结合，识别模板链。 双链DNA解链位点（前端 亚基提供） 单链DNA重旋位点（后端亚基提供） DNA/RNA杂交链结合位点（亚基提供） 有义DNA链结合位点（ 亚基提供）,6.2.1 Bacterial RNA polymerase,Enzyme Movement,DNA coding strand ( ),Rewinding point (),Unwinding point (),RNA binding site,RNA/DNA

18、 hybrid (),DNA template strand,10-17bp,原核生物RNApol (Core) 的结构与功能,RNA pol 执行多种功能：,(1) 识别DNA双链上的启动子； (2) 使DNA变性在启动子处解旋成单链； (3) 通过阅读启动子序列，RNA pol确定它自己的转录方向和模板链。 (4)催化磷酸二酯键形成，使RNA链延长 (5)最后当它达到终止子时，通过识别终止信号而停止转录。,6.2.1 Bacterial RNA polymerase,RNA聚合酶催化下列反应：,催化磷酸二酯键形成，使RNA链延长,大肠杆菌RNA聚合酶的研究得比较透彻的，这是一个分子量达50

19、多万，全酶由五个亚基组成，去掉因子的部分称为核心酶，核心酶本身就能催化核苷酸间磷酸二酯键形成。利福平和利福霉素能结合在亚基上而对此酶发生强烈的抑制作用。亚基似乎是酶和核苷酸底物结合的部位。细胞内转录是在DNA特定的起始点上开始的，因子的功能是辨认转录起始点的。亚基是酶与DNA模板结合的主要成分。亚基可能与转录基因的类型和种类有关。,6.2.2 原核生物转录的起始延伸,一、启动子（promoter）的结构和功能 二、起始过程 三、RNA链延伸,6.2.2 Transcription Initiation and Elongation of Prokaryotic,一、启动子（promoter）的

20、结构和功能,启动子(promoter)：是指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域 ，它还包括一些调节蛋白因子的结合位点。,6.2.2 Transcription Initiation and Elongation of Prokaryotic,1、启动子由两个部分组成,上游部分 CAP-cAMP结合位点： （基因表达调控的正控制位点） CAP（catabolite gene Activator Protein）：降解物基因活化蛋白，环腺苷酸（cAMP）的受体蛋白。 下游部分 RNApol的进入（结合）位点 35 10 包括识别位点和结合位点（R B位点）,2、 RNA聚

21、合酶的进入位点,（1）Sextama 框（Sextama Box） -35序列，RNA聚合酶的松弛（初始）结合位点 RNA聚合酶依靠其亚基识别该位点，为转录选择模板识别位点（R位点） 大多数启动子中共有序列为T82T84G78A65C54A45 重要性:很大程度上决定了启动子的强度（RNApol 的因子）,（2） Pribonow 框（Pribonow Box）,-10序列是由Pribnow和Schaller（1975）发现，故也称为Pribnow框盒（Pribnow box）。 -10序列，RNA聚合酶的牢固结合位点 结合位点（B 位点） 一致序列：T80A95T45A60A50T96 (T

22、ATPUAT) 因此又称TATA Box 位置范围 4 到13,（3）转录起始位点（I）,1位点 RNA聚合酶的转录起始位点 转录开始时模板上的第一个碱基在原核中常为A或G 而且位置固定,6.2.2 Transcription Initiation and Elongation of Prokaryotic,典型启动子的结构,-35 -10 转录起点 TTGACA 16-19bp TATAAT 6-9bp,6.2.2 Transcription Initiation and Elongation of Prokaryotic,起始过程,封闭的二元复合体,全酶,开放的二元复合体,三元复合体,RN

23、A合成起始,RNA核心酶和全酶在DNA上的分布:,(1) 和1/3的RNA pol结合成全酶，或在非特异位点的松散复合体中，或在启动子中的二元复合体中； (2) 其中半数的核心酶从事转录； (3) 余下的核心酶大量存在于闭合松散复合 体中； (4) 估计数量很少的全酶是游离的。,6.2.2 Transcription Initiation and Elongation of Prokaryotic,7,由于RNA聚合酶分子很大，大约能覆盖70bp的DNA序列，因此酶分子上的一个适合部位就能占据从-35到-10序列区域（图）,大肠杆菌RNA聚合酶识别的启动子区,三、RNA链延伸,6.2.2 Tr

24、anscription Initiation and Elongation of Prokaryotic,7,RNA酶促合成的特点： （1）合成原料：ATP、GTP、CTP、UTP （2）RNA在NDA模板上以RNA聚合酶酶促合成 （3）只有一条DNA链作为一个基因的RNA模板，这可用人工分子杂交试验证实。 （4）RNA链按照53方向（DNA链的35）定向合成，因此RNA5端为三磷酸键。,RNA链的延长,RNA链的延长靠核心酶的催化，在起始复合物上第一个GTP的核糖3-OH上与DNA模板能配对的第二个三磷酸核苷起反应形成磷酸二酯键。聚合进去的核苷酸又有核糖3-OH游离，这样就可按模板DNA的指

25、引，一个接一个地延长下去。因此RNA链的合成方向也是5-3。 由于DNA链与合成的RNA链具有反平行关系，所以RNA聚合酶是沿着DNA链3-5方向移动。,整个转录过程是由同一个RNA聚合酶来完成的一个连续不断的反应，转录本RNA生成后，暂时与DNA模板链形成DNARNA杂交体，长度约为12个碱基对，形成一个转录泡。 转录的延长阶段，原核生物与真核生物之间没有太大差别。,6.2.3 原核生物转录的终止Transcription termination of Prokaryotic,一、 终止子的种类 二、 原核生物转录的终止,6.2.2 Transcription termination of

26、Prokaryotic,6.2.3.1 终止子的种类,DNA模板上的转录终止信号有两种情况： 一类是不依赖于蛋白质因子而实现的终止作用， 另一类是依赖蛋白质辅因子才能实现终止作用，这种蛋白质辅因子称为释放因子，通常又称因子。,两类终止信号有共同的序列特征，在转录终止之前有一段回文结构，回文序列是一段方向相反，碱基互补的序列，在这段互补序列之间由几个碱基隔开；,不依赖因子的终止序列中富含GC碱基对，其下游6-8个A； 而依赖因子的终止序列中GC碱基对含量较少，其上游也没有固定的特征，其转录生成的RNA可形成二级结构即发夹结构，这样的二级结构可能与RNA聚合酶某种特定的空间结构相嵌合，阻碍了RNA聚合酶进一步发挥作用。,除DNA模板本身的终止信号外，在入噬菌体中，发现一些蛋白质有协助RNA聚合酶跨越终止部位的作用，叫做抗转录终止蛋白，例如入噬菌体的N基