实验6.细胞骨架的观察.ppt

1、实验六 细胞骨架的观察,生命科学学院,细胞生物学实验,一、实验目的 掌握细胞骨架的基本制作方法。 了解光学显微镜下细胞骨架的基本形态结构。,二、实验原理 细 胞 骨 架 ：是 指 细 胞 质 中 纵 横 交 错 的 纤 维 网 络 结 构 ， 由微丝、微管和中间纤维构成。它对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。 用适当浓度的TritonX-100处理细胞，可以去除细胞中的非骨架成分，而将细胞骨架成分完好保存。经戊二醛固定、考马斯亮蓝R250染色，光镜下可以观察到细胞内由微丝组成的微丝束网状结构，就是细胞骨架。,三、实验用品： 试剂: M-缓冲液、1Triton

2、X-100、3.0%戊二醛、0.2%考马斯亮蓝R250、蒸馏水 材料: 洋葱鳞茎 器材：滴管、镊子、移液枪、小烧杯、载玻片、盖玻片、滤纸条 设备：显微镜、恒温箱,M缓冲液： 成分：咪唑、EDTA、EGTA、MgCl2等。 咪唑是一种缓冲剂，稳定骨架蛋白，维持细胞渗透压；EDTA和EGTA螯合Ca2+，溶液中提供Mg2+；保持低钙环境，使骨架纤维保持在聚合状态并且较为舒张。,1% Trion X-100 溶液： Triton X100是一种非离子型去垢剂，可以将细胞质和膜中的游离蛋白和全部脂类溶解抽提，而微丝束不会被Triton 破坏而保留在细胞中。通过Triton的处理，除去部分杂蛋白，使细胞

3、骨架显现更清晰。 注意：处理时间过长，也会破坏骨架！,0.2% 考马斯亮蓝R250染液： 考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，可以使细胞内各种蛋白质染色。本实验中，有些骨架纤维(微管，20-25nm)不稳定；有些纤维(中间纤维，8-11nm)太细，在光学显微镜下无法分辨。 所以，我们观察到的主要是微丝束，由许多微丝（5-7nm）结合在一起，直径约在40nm左右，考马斯亮蓝R250染色对微丝束的显示起了夸大的作用。,3%戊二醛： 戊二醛是一种双交联剂，渗透快、交联能力强，对蛋白质的固定效果好，且不破坏细胞骨架的结构。,取材：撕取洋葱鳞茎近中轴内表皮，浸入装有5ml PBS溶液的小烧杯中 ，

4、使其下沉，处理3次，每次3min。 抽提：吸去 PBS溶液，加 3ml 1 % Triton X-100 入小烧杯，置 37 恒温箱处理20min。 冲洗：吸去 TritonX-100 ，用 3ml M缓冲液轻轻洗 3 次，每次 3min。 固定：加 5ml 3% 戊二醛固定15min。 冲洗：弃固定液后，用5ml PBS溶液洗3次，每次3min，最后，用滤纸吸去残留液体。,四、实验方法与步骤：,染色：吸去 PBS溶液，滴 3ml 0.2% 考马斯亮蓝 R250 染液染色10-15 min。 制片：倒去染液，用蒸馏水清洗 2-3次，将标本平铺在载玻片上，加盖玻片。 观察：光镜下观察可见表皮细胞

5、的轮廓，细胞内存在着被染成蓝色、粗细不等的纤维网络结构，便是细胞骨架。转高倍镜下观察，转动微调可见细胞骨架的立体结构。,五、注意事项： 撕取洋葱鳞茎内表皮不可带茎肉，样本要展开铺平。 去垢处理要掌握好时间和温度。 染色时间需掌握好，必要时可分不同时间进行染色。 观察时选择平展、染色适中的部位观察。,六、作业及思考：,绘出洋葱内表皮细胞细胞质骨架的分布图。 1%TritonX-100处理细胞的作用是什么？ M-缓冲液有何作用？,实验结果：,光镜的低倍镜下，可见到规则排列的长方形洋葱表皮细胞轮廓，细胞内可见到被染成蓝色的粗细不等的分枝状结构，这便是细胞骨架。高倍镜下继续观察，调节细准焦螺旋可以看到细胞骨架的立体结构。,溶液配制： M-缓冲液 咪唑 3.40 g，氯化钾 3.70g，氯化镁(MgCl2.6H2O) 101.65 mg，EGTA（乙二醇双醚四乙酸）330.35mg，EDTA（乙二胺四乙酸）29.22mg，巯基乙醇 0.07ml，甘油 292 ml，蒸留水加至 1000 ml。 1%Triton X-100溶液 Triton X-100 1ml + M-缓冲液 99 ml 。 0.2% 考马斯亮蓝R250染液 考马斯亮蓝R250 0.2 g，甲醇 46.5 ml，冰乙酸 7 ml，蒸馏水 46.5 ml。 3.0%戊二醛 25% 戊