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文档简介

1、亲和层析，第一，原理，亲和层析是一种利用生物大分子的特异性亲和力来寻找配体并将其固定化，使之成为亲和层析柱的纯化技术，基本过程，固相，吸附，解吸，载体，酶：基质类似物，抑制剂，辅酶抗体：抗原，病毒，细胞：细胞表面特异性蛋白，凝集素核酸：互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶激素或药物：受体，载体蛋白凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞，具有特异性亲和力的常见生物分子对：(1)载体选择，1。载体要求：(1)不溶性(2)渗透性：松散的网络结构，良好的液-液流动性(3)稳定的化学和机械性能(4)大量的基因可以被激活(5)抗微生物和酶的攻击；2)普通载体(1)纤维素的特点：价格低廉，纤维来源充足，异质性

2、限制了大分子的掺入和非特异性吸附，严重用于抗体和酶的纯化；(2)葡聚糖凝胶特性：化学和物理性质稳定，孔隙率低于琼脂糖(3)琼脂糖凝胶，其浓度为2%琼脂糖2B 4%琼脂糖4B 6%琼脂糖6B。凝胶浓度越低，结构越松散，机械强度越低。(4)聚丙烯酰胺凝胶，(5)多孔玻璃特点：不受微生物侵袭，耐酸、碱、有机溶剂表面的非特异性吸附。特点：理化性质稳定，抗微生物攻击能力强于琼脂糖，化学反应酰胺基团多，(2)配体选择，1。对待纯化物质的特异性亲和力。可以修饰的官能团，以酶和底物为例。当L0E 0 KL=E0-EL0/EL=E0-EL0-EL/EL0，L0:初始浓度时，L0E 0 KL=E0-EL0/EL=

3、E0-EL0/KL KD=结合酶/游离酶=El/E0-El=l0/KL，KL:解离常数(3)固化。配体通过共价键与固体基质相连，形成固体吸附剂。载体的排斥效应是载体的空间屏障。2.亲和层析分离，1。装载柱和平衡2。样品装载，亲和吸附3。洗脱，无效洗脱，低吸附效率和有效吸附。洗脱方法：(1)非特异性洗脱：通过改变洗脱液的酸碱度梯度洗脱离子强度；(2)特殊洗脱：当蛋白质被紧密吸附或用上述方法洗脱将导致失活时，配体和载体之间的连接可以用特定的化学方法来裂解，然后用透析或凝胶色谱法除去配体。破键方法：硫酯键、偶氮键和二硫键(3)被特异性洗脱，用过的柱被再生以除去非特异性吸附的杂质。再生步骤可重复使用：初始缓冲液重复平衡一次，用高离子强度和低离子强度溶液处理，用弱酸或弱碱溶液处理；4.亲和柱再生：3。特征，1 .一步纯化步骤2。这种产品非常纯净。3.它可以从非常稀的溶液中提纯成所需的物质。4.它可以去除变性或部分降解的物质。4.申请。1.分离和纯化。2.区分化学或基因修饰的酶。3.纯化亲和标记的活性中心

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