07第七章-细胞工程制药

1、第七章 细胞工程制药,第一部分、微生物细胞工程 第二部分、植物细胞工程 第三部分、动物细胞工程 第四部分、生物反应器以及工作原理 第五部分、动物活体组织和器官培养器,第一部分、微生物细胞工程,一、工业上常用微生物 二、工业微生物营养源 三、工业微生物培养基的配制 四、工业微生物的筛选要求 五、微生物细胞培养方法 六、微生物原生质体技术 七、微生物工程的实际应用 八、 酵母基因工程,一、工业上常用微生物,1、细菌 （1）枯草芽孢杆菌-产蛋白质、淀粉酶 （2）乳酸杆菌-产乳酸 （3）梭状芽孢杆菌-产丙酮、丁醇 （4）醋酸杆菌-产醋酸 （5）北京棒状杆菌-产味精 （6）产氨短杆菌-产氨基酸、核苷酸

2、2、放线菌 （1）龟裂链霉菌-产链霉素 （2）金黄色链霉菌-产金霉素 （3）灰色链霉菌-产链霉素 （4）红链霉菌-产红霉素 （5）红小单孢菌-产庆大霉素 （6）委内瑞拉链霉菌-产氯霉素 （7）卡那链霉菌-产卡那霉素 3、酵母菌-用于生产饮料酒、酒精、甘油、柠檬酸、富马酸、脂肪酸、单细胞蛋白、酵母类酶、乳糖酶，也用于提取RNA、核苷酸、CoA。 4、霉菌 （1）黑曲霉-生产淀粉酶、蛋白酶、柠檬酸、葡萄糖酸 （2）米曲霉-生产酱油 （3）产黄青霉-产青霉素 （4）展开青霉-产灰黄霉素 （5）米根霉-制曲、生产乳酸,二、工业微生物营养源,1、碳源 （1）淀粉水解物-谷物、马铃薯、红薯、木薯淀粉水解产

3、物。 （2）含糖类物质-麦芽糖、糖蜜、乳精、玉米浆。 （3）工业植物油-橄榄油、玉米油、亚麻子油、棉籽油、黄豆油。 （4）其它物质-黄豆粉、醇类、简单有机酸、石油、天然气。 （5）纤维素类-秸杆、玉米蕊、稻草、木材、麦草。 2、氮源 无机氮-铵盐、硝酸盐、氨气、硫酸铵。 有机氮-氨基酸、蛋白质水解物、尿素、黄豆粉、花生粉、鱼粉、棉籽粉、玉米粉、酒糟水、屠宰场废水。 3、无机盐 KH2PO4K2HPO4 NaH2PO4MgSO4 MnSO4FeSO4 KNO3 4、维生素-在天然氮源及碳源中均含有多种维生素，在培养基中无需添加。,三、工业微生物培养基的配制,1、工业培养基的一般要求 （1）单位重

4、量培养基的产物或菌体生成产量应尽可能高。 （2）菌体或产物浓度应尽可能大。 （3）不引起不良反应。 （4）质量稳定、易于获得。 （5）发酵过程易于通气、搅拌，产品易于回收、三废少。 2、培养基配制原则 （1）营养成份配比应适当，尤其是C/N比例应附合要求。C/N比过小，菌体生长过快，菌体容易衰老。C/N比过大，菌体生长缓慢。 （2）渗透压应适合。 （3）PH值应适合，常用磷酸缓冲液来维持PH值。 （4）氧化还原电位应附合要求，常在培养基中加入巯基乙酸钠、Na2S、Na2S2O3、抗坏血酸来稳定电位值。,四、工业微生物的筛选要求,（1）菌种应具有稳定而高产的遗传特征 （2）菌种应具有搞噬菌体的能

5、力 （3）发酵过程的泡沫量少 （4）需氧量低 （5）底物转化量高 （6）对培养基中的特定物质应具有较强的耐受力 （7）可以采用廉价的培养基进行培养 （8）最适温度较高，以降低设备冷却费用 （9）菌种的基因具有可操作性和修饰性 （10）产品容易从发酵液中回收,五、微生物细胞培养方法,1、固体培养（1）浅盘培养（2）转桶培养（3）厚层通风培养 2、液体培养根据培养物厚度可分为（1）液体表面培养法（2）液体深层培养法根据投料方式可分为（1）分批培养法（2）分批补料培养法（3）连续培养法,六、微生物原生质体技术,1、原生质体的定义-原生质体是除去细胞壁的裸体细胞，但是却仍然保持着完整的细胞遗传特性和生

6、理生化特征，并且在适当条件下仍能够再生细胞壁而形成完整细胞。 2、原生质体的制备 3、原生质体的融合技术 4、原生质体融合实例-细菌原生质体融合,2、原生质体的制备,（1）细胞壁的脱除 脱除细胞壁的方法有酶法、机械法。 常用酶法脱除细胞壁，因为酶法除细胞壁有利于提高原生质体的存活率。常用的酶有-溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、壳多糖酶、酵母裂解酶、溶解酶、溶球菌素。 为了提高酶的消化效果，常常在培养基中加入细胞壁合成抑制剂进行预处理。常用的抑制剂有-甘氨酸、蔗糖、青霉素、a-脱氧葡萄糖。 （2）原生质体的特性 原生质体对于溶液和培养基渗透压特别敏感，必须保存在高渗和等渗溶液中才能存活。否则就会裂解死

7、亡。 高渗溶液称为原生质体的稳定液。 高渗溶液的配制-常常用蔗糖、葡萄糖、甘露醇、琥珀酸、氯化钠、氯化钾来配制高渗溶液。,3、原生质体的融合技术,（1）原生质体的基本过程和不足之处 （2）促融剂 （3）原生质融合子的鉴别和检出,（1）原生质体的基本过程和不足之处,基本过程： 取一定浓度的二种不同微生物的原生质体，悬浮于培养液中，然后在促融剂（聚乙二醇）的作用下，二者相互凝聚，首先发生细胞膜融合、然后二种原生质体的基因开始接触并且交换，最后实现基因重组。 不足之处： A从菌落中挑选融合子的操作十分繁琐。 B融合后的重组子常常不稳定，容易分离而复原成为亲本类型，融合子的不稳定性是最大的难题。 C融

8、合子的产物有高有低、整齐不一，常常需要再进行筛选。,（2）促融剂,聚乙二醇（PEG）对原生质体的融合具有良好的促进作用，但其作用机理尚不清楚。 PEG有不同聚合度的产物，其分子量有1000D、2000D、4000D、6000D、12000D、20000D等类别，进行细菌原生质体融合操作时，常常采用分子量较高者。 PEG在低浓度时常用作原生质体稳定剂，同时低浓度PEG有促进核分裂、促进细胞壁再生的作用。 但是PEG对原生质体有害，只能进行短时间处理，通常只作用1min，然后立即进行稀释以解除其毒性。,（3）原生质融合子的鉴别和检出,如果二亲本分别为营养缺陷型A+B-、A-B+，那么经过融合后的重

9、组体则可能为A+B+、A-B-， 如果二亲本分别为抗药性菌株SrTs、SsTr，那么经过融合后的重组体则可能为SsTs、SrTr， 重组子检出方法分为二种： A、直接检出法-将融合后的混合原生质体培养在高渗再生培养基平板之中，不加二亲本生长所需要的营养物、这样就能够直接选择出原营养型杂种菌株。或者同时补充二种抗性药物，就可以选择出具有双重抗药性的杂种菌株。 B、间接检出法-先把融合液涂布于高渗再生培养基平板之中，使亲本和重组子都能够生长，然后再影印复制到选择性培养剂之中，凡是能够生长者即为经过融合的杂种菌株。,4、原生质体融合实例-细菌原生质体融合,（1）供融合用亲本菌株 （2）直接亲本标记的

10、获得 （3）原生质体制备 （4）原生质体再生成细菌菌落 （5）原生质体融合子的检出 （6）融合子的继代培养以及验证 （7）融合结果,选择亲本菌株并进行亲本标记,（1）供融合用亲本菌株 枯草杆菌AS1-398 地衣芽孢杆菌AS1-807 二者均为野生型，对利福平和链霉素敏感。 （2）直接亲本标记的获得 用紫外线照射诱变，选择营养缺陷型菌株和抗药性菌株。 经过10代以上的传代试验。 取稳定的突变株作为融合亲株。,原生质体制备和细菌菌落再生,（3）原生质体制备 将二亲本分别接入完全培养基之中，32摇瓶培养20小时经4000r/min离心15min，洗涤2-3次，弃去上清液将菌体悬浮于0.5mol/L

11、蔗糖高渗溶液之中，并使菌体浓度为原始浓度的5倍左右。加入0.5mol/L蔗糖高渗溶液配制的溶菌酶1万单位/升，于25保温，定时取样镜检，用计数板计数，直到形成球形原生质体。经4000-6000r/min离心二次，每次15min。经过适当稀释后，涂布于完全培养基之中，32培养20小时计数，即得原生质体。 （4）原生质体再生成细菌菌落 取上述原生质体悬液，置于0.55mol/L的NaCl溶液之中经过适当稀释后，涂布于完全培养基之中，32培养24小时即得由原生质体再生成细菌菌落。,融合子的检出继代培养和融合结果,（5）原生质体融合子的检出 取等量的二种亲本的原生质体，加入蔗糖高渗液混匀，经4000r

12、/min离心25min，倾去上清液加入2-4ml含30% PEG的蔗糖高渗溶液，40搅拌均匀，保温2-3min。加3-10倍（V/V）蔗糖高渗溶液吸取适量融合液，每个培养皿为0.1-0.25ml，涂布于高渗基础培养基平板上、含有二种抗生素（2000u/ml链霉素 + 10u/ml利福平）的高渗完全培养基平板上32培养20-26小时，得初步融合子。 （6）融合子的继代培养以及验证 将获得的种间融合子在含有二种抗生素（2000u/ml链霉素 + 10u/ml利福平）的高渗完全培养基平板上连续传代培养，就可以检测出重组融合子。 （7）融合结果 二种产蛋白酶的芽孢杆菌融合之后，其营养缺陷型、抗药性可以

13、互补。重组菌的产量较亲株高出30%。,七、微生物工程的实际应用,1、微生物工程产品的类型 2、微生物工程在医药上的应用 3、微生物工程在食品工业中的应用,1、微生物工程产品的类型,（1）微生物菌体 酵母菌白僵菌灵芝密环菌 猴头菌竹红菌冬虫夏草 （2）初级代谢产物 微生物在代谢过程中所形成的产物为自身生长繁殖所必需的营养物质，称为初级代谢产物。有多种氨基酸、核苷酸、糖类、有机酸、维生素、乙醇、丙酮、丁醇、黄酒、啤酒、酱、醋、乳酪。 （3）次级代谢产物 微生物在代谢过程中所形成的产物，属于自身生长繁殖所不需要的物质，称为次级代谢产物。有多种抗生素类药品、甾体类药品、酶的抑制剂、毒素。 （4）生物大

14、分子 酶类活性蛋白质蛋白类激素 核酸多糖天冬酰胺酶 DNA透明质酸酶右旋糖苷 人脑激素干扰素人胰岛素,2、微生物工程在医药上的应用,（1）抗生素类药物 （2）氨基酸类药物 （3）核苷酸类药物 （4）维生素类药物 （5）甾体类药物 （6）酶和酶的抑制剂类药物,（1）抗生素类药物,A、抗细菌抗生素 杆菌肽头孢菌素氯霉素金霉素 环丝氨酸红霉素庆大霉素卡那霉素 青紫霉素柱晶白霉素林可霉素麦迪霉素 新霉素新生霉素竹机霉素土霉素 巴龙霉素青霉素磷霉素多粘菌素 核糖霉素利福霉素螺旋霉素链霉素 四环素托普霉素万古霉素紫霉素 B、抗真菌抗生素 两性霉素杀假丝菌素灰黄霉素制霉菌素 C、抗肿瘤抗生素 放线菌素阿德里

15、亚霉素博莱霉素光辉霉素 丝裂霉素肉瘤霉素 D、半合成抗生素 青霉素、以及头孢类等天然抗生素经过酶解、或者用其它方法除去侧链、或者接上新侧链之后，就构成了新的抗生素，称为半合成抗生素；它们分别有以下类型： 半合成青霉素-甲氧苄青霉素、乙氧萘青霉素、苯唑青霉素。 半合成头孢菌素-头孢1号、2号、3号、4号 其它类半合成抗生素-丁胺卡那霉素、强力霉素（去氧土霉素）、乙酰螺旋霉素。,（2）氨基酸类药物,A、采用微生物发酵法生产的氨基酸 谷氨酸赖氨酸丙氨酸 精氨酸组氨酸异亮氨酸 亮氨酸苯丙氨酸脯氨酸 苏氨酸色氨酸酪氨酸 缬氨酸瓜氨酸鸟氨酸 B、采用酶转化法生产的氨基酸 天门冬氨酸丙氨酸蛋氨酸 苯丙氨酸色

16、氨酸赖氨酸 酪氨酸半胱氨酸谷氨酰胺 天冬氨酸,利用微生物生产的其它类药物,（3）核苷酸类药物 肌苷酸肌苷5-腺苷酸（AMP） 辅酶A（CoA）辅酶I（CoI）胞二磷胆碱（CDP） 三磷酸腺苷（ATP）黄素腺嘌呤二核苷酸（FDA） （4）维生素类药物 维生素B2维生素B12维生素C原料（2-酮基-古龙酸） 维生素A前体（类胡萝卜素）维生素D前体（麦角甾醇） （5）甾体类药物 可的松氢化可的松泼尼松 肤轻松地塞米松 （6）酶和酶的抑制剂类药物 天冬酰胺酶脂肪酶蛋白酶 纤维素酶链激酶尿激酶 超氧化物歧化酶抑肽素多巴丁,3、微生物工程在食品工业中的应用,（1）含醇饮料 葡萄酒果酒啤酒香槟酒 （2）调味

17、品及发酵食品 酱酱油醋豆豉 腐乳饴糖泡菜 （3）乳制品 奶酒干酪酸奶 （4）食品原料 葡萄糖麦芽糖果葡糖甘露糖醇 （5）食品添加剂 味精赖氨酸柠檬酸红曲色素 甜味二肽异维生素C乳链霉菌肽 （6）酶类 -淀粉酶-淀粉酶糖化酶异淀粉酶 转化酶异构酶半乳糖酶碱性蛋白酶 酸性蛋白酶中性蛋白酶纤维素酶果胶酶 脂肪酶凝乳酶过氧化氢酶,八、 酵母基因工程,（一）酵母的特征 （二）酵母宿主系统 （三）酵母载体系统 （四）酵母转化系统 （五）酵母表达系统 （六）应用实例-乙肝疫苗的生产,（一） 酵母的特征,1、酵母菌（Yeast）-是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲，担子菌纲，半

18、知菌纲，共有56个属，500多个种。酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。 2、工程优点： （1）全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便。 （2）具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统。 （3）大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉。 （4）能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 （5）酵母菌是最简单的真核模式生物酵母菌是最简单的真核模式生物。,（二） 酵母宿主系统,常用酵母,能提高重组异源蛋白产率的诱变酵母菌,（三）酵母的载体系统,1、野生型质粒如： （1）酿酒酵母中的2环状质粒 （2）乳酸克鲁维酵母的线状质粒 2、克隆表达质粒的构建 酵母自主复制质粒包括复制子，标记

19、基因与克隆位点。 3、复制子类型： ARS：酵母菌的自主复制序列。 YRp2：质粒复制起始位点。 Yep：,穿梭质粒,（四）酵母的转化系统,1、转化方法 （1）原生质体转化法-去除酵母细胞壁，在钙离子及PEG的存在下使细胞接纳质粒。周期长，转化率不稳定。 （2）电转化法-电击酵母细胞，造成细胞穿孔，接纳质粒。转化效率高，但是参数设置比较麻烦，需要点转化仪。 （3）乙酸锂转化法-在锂离子的存在下，使细胞膜性质改变，接纳质粒。操作方便，转化率稳定。 2、转化子的筛选标记： （1）营养缺陷型互补基因：LEU，TRP，HIS，URA等。同时要求受体菌相应基因缺陷。 （2）显性标记基因：主要是毒性物质的

20、抗性蛋白。如cat：抗氯霉素基因，cup1：铜离子耐受基因。,（五） 酵母的表达系统,1、启动子的可控性 2、表达系统的选择,1、启动子的可控性,酿酒酵母常用温度控制表达。 甲醇酵母可以用甲醇作为诱导物。,2、表达系统的选择,（六）应用实例-乙肝疫苗的生产,乙肝病毒： （1）二十面体核衣壳，2527nm。 （2）主要结构蛋白为C蛋白，又称核心抗原（HBcAg）。 （3）具有包膜，直径3545nm。 （4）包膜表面的病毒蛋白，乙肝表面抗原（HBsAg）。,第二部分、植物细胞工程,一、植物细胞培养概况 二、植物细胞培养的基本概念 三、植物细胞培养的技术流程 四、植物细胞工程的应用 五、植物细胞培养

21、的实例,一、植物细胞培养概况,1、可供培养的植物种类 （1）到目前为止，有研究显示，近300种植物的细胞培养物能够产生400多种有效的药用成份。 （2）许多药用植物如人参、长春花、紫草、甘草、紫杉、银杏、黄连等，其细胞培养十分成功。 （3）据初步统计，有约30种化合物在培养细胞中的含量已经超过1%，如紫草素的含量可达12%、小檗碱的含量可达1%，人参皂苷可达7%。 2、目前现存的问题 （1）技术工艺还不够成熟。 （2）提高单位培养基中有效物质的产量 （3）降低目的产物的生产成本 （4）改进培养条件 （5）筛选高产细胞株 （6）研制适合于植物细胞培养的新型反应器,二、植物细胞培养的基本概念,1、

22、植物细胞培养的定义-植物组织和细胞培养是指在无菌条件、人工控制的营养和培养基、人工控制的环境条件如光照、温度下，研究植物的细胞、组织、器官，以及控制其生长发育的技术。 2、植物细胞培养的类别-13大类 3、次级代谢产物和植物细胞的培养特性,2、植物细胞培养的类别（1-6）,（1）植物培养-幼苗和较大植株的培养称为植物培养。 （2）愈伤组织培养-从植物体各种器官的外植体通过增殖而形成的愈伤组织，并对其进行培养的方法，称为愈伤组织培养。 （3）悬浮培养-能够保持较好分散性的离体细胞、或者是较小的细胞团的液体进行培养的技术称为悬浮培养。在此培养条件下获得的细胞组织化程度较低。 （4）器官培养-离体器

23、官如茎尖、根尖、叶片、花器官各部分原基、未成熟的花器官各部分、未成熟的果实的培养，称为器官培养。 （5）胚胎培养-对于未成熟或者成熟的胚胎进行离体培养的方式，称为胚胎培养。在培养过程中，如果小植株的发生途径与正常的受精卵发育方式相同，这一过程就称为“胚胎形成”。如果在体细胞或者花药的培养中，培养物是小孢子这样的单倍体细胞，则它所形成的结构就称为“胚状体或不定胚”。 （6）细胞培养-是指利用单个细胞进行液体或者固体培养，并诱导其增殖、分化，其目的是为了得到单细胞无性繁殖系。,2、植物细胞培养的类别（7-13）,（7）分生组织培养-又称生长锥培养，是指在人工培养基中培养茎端分生组织。茎端分生组织仅

24、仅位于茎尖顶端的园锥区，其长度小于0.1mm。 （8）外植体培养-外植体是指植物组织器官的切段，如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉进行培养称为外植体培养。 （9）器官形成-是指在组织培养和悬浮培养基中，植物芽、根、花等器官的形成一分化。首先形成小根基，然后在其基部迅速形成愈伤组织，然后再形成芽、最后形成小植株的过程。 （10）无性繁殖系-又叫克隆，是指通过对培养物进行反复的继代培养，利用同种外植体来获得越来越多的无性繁殖系。如根无性系、组织无性系、悬浮培养物无性系。 （11）突变体-细胞本身由于变异、或者是通过应用诱变技术进行处理，所获得的遗传变异性新细胞，称为突变体。 （12）

25、原代培养和继代培养-由外植体上切下来的组织细胞的第一代培养称为“原代培养”、从此以后的多代培养则称为“继代培养” （13）连续培养-是指在培养罐中不断地加入新的培养基、并且连续收集培养物，以保持反应平衡而进行的长期不转移的培养方式。,3、次级代谢产物和植物细胞的培养特性,1、植物体内次级代谢产物具有以下特征： （1）有明显的分类学区域界限， （2）其合成需要在一定条件下才能进行， （3）缺乏明显的生理功能， （4）是生命过程的多余成份。如生物碱、黄酮类、萜类、有机酸、木质素。 2、植物细胞的培养特性： （1）植物细胞较微生物细胞大得多，具有纤维素细胞壁。 （2）培养过程生长速度缓慢，易受微生物

26、污染、需要用抗生素。 （3）在细胞生长的中期和对数期，容易凝聚成直径达350-400um的团块，悬浮培养比较困难。 （4）培养时需要供氧，培养液粘度较大，不能耐受强力通风搅拌。 （5）细胞具有群体效应、无锚地依赖性和接触抑制性。 （6）细胞培养产物多数滞留于细胞内，产量较低。 （7）培养过程具有结构、功能上的全能性。,三、植物细胞培养的技术流程,（一）植物材料的准备和处理 （二）培养基 （三）培养方法 （四）植物细胞种质保存技术 （五）植物细胞突变体筛选技术 （六）植物原生质体培养技术 （七）植物细胞融合技术 （八）影响植物次级代谢产物积累和诸因素分析,（一）植物材料的准备和处理,用于植物组织

27、培养的外植体，必须是无菌材料。因此在培养之前，必须对外植体进行严格的灭菌处理。植物不同的组织，所需要的灭菌步骤也各不相同 1、常用的灭菌试剂 2、灭菌步骤,1、常用的灭菌试剂,次氯酸钙9-10%5-30分钟次氯酸钠0.5-5%5-30分钟过氧化氢3-12%5-15分钟溴水1-2%2-10分钟硝酸银1%5-30分钟氯化汞0.1-1%2-10分钟抗生素4-50mg/L30-60分钟 最常用的是-次氯酸钠、次氯酸钙、氯化汞。,2、灭菌步骤,（1）种子 灭菌前处理-纯酒精中浸泡10分钟，再用无菌水漂洗。 灭菌-100g/L次氯酸钙浸泡20-30min，再用10g/L溴水浸泡5min。 灭菌后处理-无菌

28、水洗3次，然后在无菌水中发芽。 （2）果实和茎切段 灭菌前处理-纯酒精漂洗 灭菌-20g/L次氯酸钠浸泡10min 灭菌后处理-无菌水反复冲洗3次，然后再剖开内部种子。 （3）储藏器官和叶片 灭菌前处理-自来水洗净 灭菌-20g/L次氯酸钠浸泡20-30min 灭菌后处理-无菌水反复冲洗3次、滤纸吸干。,（二）培养基,1、植物细胞的营养需求 2、培养基的组成成份 3、培养基的配制原则和常见的培养基类型,1、植物细胞的营养需求,（1）无机营养物- N、P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Mo （2）维生素-维生素B1、B6，烟酸、肌醇、生物素、泛酸钙、叶酸。 （3）碳源-蔗糖、葡萄糖

29、、木糖、甘露醇、山梨醇。 （4）天然物-水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取物、香蕉汁、荸荠汁、苹果汁。 （5）氨基酸类-甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、天冬酰氨、酪氨酸、精氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、胸腺嘧啶。 （6）核酸及其水解物- DNA、RNA、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶。 （7）植物激素： 生长素类-吲哚-3-乙酸（LLA）、赤霉素（GA3） 细胞分裂素类-6-苄氨基嘌呤（BA）、脱落酸（ABA）、乙烯萘乙酸（NAA）、 2、4-D、 吲哚乙酸。 其它激素类-长蠕孢醇、核盘菌素、油菜素内酯、三十

30、烷醇、肽类、半支莲醇、月光花素、石蒜素、玉米素、向日葵素、精子囊素。 （8）其它成份-氯化胆碱、胆质素、苹果酸、反丁烯二酸、固形剂、琼脂。,2、培养基的组成成份,AlCl3CaCl2*2H2OCa（NO3）2*4H2O CoCl3*6H2OCuSO4*5H2O FeCl3*6H2OFe2（SO4）3 FeSO4*7H2OH3BO3KCl KH2PO4KIKNO3 MgSO4*7H20MnSO4*H2O MnSO4*4H2ONaH2PO4NaH2PO4*H2O NaH2PO4*2H2ONaNO3Na2EDTA Na2EDTA*2H2ONa2MoO4*2H2O Na2SO4NH4NO3（NH4）2

31、SO4 NiCl2*6H2OZnSO4*7H20肌醇 烟碱酸泛酸盐酸吡咯醇 核黄素盐酸硫胺素,3、培养基的配制原则和常见的培养基类型,（1）培养基的配制原则 母液配制时各成份浓度应该比实际使用浓度扩大一定倍数，使用时稀释。 培养液应该维持PH值恒定，常用1mol/L的HCl、或者1mol/L的NaOH进行调节。 培养基分装之后，处加棉花塞和牛皮纸包扎，在82.74-1030.42kPa压力下、121下、消毒灭菌20min、冷却之后就可以用于接种。 （2）常见的培养基类型 Gamborgs b5培养基Hellers salts培养基 Linsmaier-Bednar & Skoog培养基Mura

32、shige& Skoog培养基 Nitshs H培养基Schenk-Hildebrandt培养基 Takebe培养基Whites-3 salts培养基,（三）培养方法,1、固体培养体系 2、液体培养体系 3、大规模工业化生产方法,1、固体培养体系,（1）定义-固体培养体系包括利用琼脂作为支持物的固体培养和固定化细胞培养技术。是指在培养基中加入一定量的凝固剂，经过加热溶解装瓶冷却凝固之后形成固体培养基。 （2）常用的固化剂 琼脂藻酸盐角叉藻聚糖明胶羟乙基纤维素聚丙烯酰胺 淀粉硅胶 （3）优点-简便易行、所占空间较小。 （4）缺点： 外植体或愈伤组织只有一部分与培养基发生接触，接触部位的营养物质可

33、被迅速吸收，从而形成培养基中营养物质的浓度差，结果导致愈伤组织的生长不平衡。 由于外植体的基部插入到固体培养基中，使得此外呈现出气体交换不畅的状态，阻碍了组织呼吸作用的正常进行，同时也会大量堆积生长过程中积累的有害物质。 由于重力作用，以及光线从上部或者一侧射入，常常导致愈伤组织细胞间出现极化现象，结果导致细胞细胞群体的不均匀。 当固体培养出的植株转入液体环境时，常常导致组织很快膨胀。,2、液体培养体系,（1）悬浮培养法 （2）平板培养法 （3）微室培养法 （4）看护培养法,（1）悬浮培养法,A、定义-游离的植物细胞悬浮于液体培养基中进行培养的方法称为悬浮培养法。 B、基本步骤-将愈伤组织、无

34、菌苗、吸涨的胚胎、外植体尖芽、根尖、叶肉组织，经匀浆器械掏碎，纱布或者不锈钢网过滤，提到的单细胞滤液作为接种材料，接种于试管或者培养皿中进行振荡培养。 C、特点-其培养过程能够严格地出现重复的周期性变化，所培养的细胞具有典型的指数增长规律，分别有延迟期、对数生长期、减慢生长期、静止期。需要进行不断的继代培养。,（2）平板培养法,A、定义-分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基器皿内进行培养的过程称为平板培养方法。 B、基本步骤-将消化分散后的细胞在除去消化液之后，经过浓缩和计数，再接种到35左右的固体培养基之中，于25、含5%的CO2的空气培养箱之中进行培养，细胞即可生长成团。,（3）微室培养法

35、,A、定义-悬浮的单细胞接种于由玻璃环和盖玻片所构成的微室之中的固体培养基中，进行培养的方法。 B、基本步骤-在微室内预置琼脂培养基，然后接种细胞悬浮液，再盖上盖玻片，然后在盖玻片的外沿用石蜡或者凡士林进行密封，置于CO2培养箱中培养，维持温度26-28，细胞即可生长。 C、优点-能够直接观察细胞分裂和组织分化的全过程，同时可以进行显微镜摄像。,（4）看护培养法,A、基本步骤-在三角烧瓶中加入固体培养基，在培养基上放置一块直径为几毫米的愈伤组织，再地组织块上放置一张经过灭菌的滤纸，次日在滤纸上就会吸收由组织块中渗出的培养基成份，最后将细胞接种于滤纸上面，置于CO2培养箱中培养，维持温度26-2

36、8，细胞即可生长。 B、优点-操作简便，能够为单细胞生长提供良好的环境。 C、缺点-培养时间较长，不能直接进行观察,3、大规模工业化生产方法,（1）成批培养法 （2）半连续培养法 （3）连续培养法 （4）固定化培养法,（1）成批培养法,A、定义-将培养基一次性地加入到反应器之中、接种、培养一定时间之后，收获细胞的操作方法。 B、实例-1953年Tulecke设计了一个20L的培养瓶，并利用这个系统培养了银杏、冬青、黑麦草、蔷薇等植物细胞。 日本人发明了二步培养法，第一步用于细胞数量的增殖，第二步则用于次级代谢产物的街道，他们成功地生产出第一个植物细胞工程产品-紫草素。,（2）半连续培养法,A、

37、定义-在反应器中投料、接种培养一段时间之后，将部份培养液放出，同时放入等量的新鲜培养液进行置换的方法，称为半连续培养法。 B、基本步骤-每隔12天收获一部份培养物，最多可达50%，然后再加入新鲜培养液，通过调整收获次数来维持细胞重量的恒定。 C、实例-1972年，Kato用大规模半连续培养方法生产烟草细胞。,（3）连续培养法,A、常规连续培养法 是指利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间之后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样的速度供给新鲜培养基、使得细胞生长环境长期维持恒定的方法。 优点-其细胞的生产能力要比成批培养法高。 缺点-由于细胞培养时间长，要维持系统长时间的无菌状态，技

38、术条件要求较为苛刻。 B、二阶段连续培养法 设置二个培养罐，第一罐中投入生长培养基用于实现细胞增长，生产过程中进行连续投入。第二罐中投入生产培养基用于生产细胞次级代谢产物。二罐间通过管道连接。第一罐中的产物流到第二罐，第二罐的产物定期放出。 优点-可大提高细胞生长速度。 实例-生产烟草细胞，第一罐中投入含N的生长培养基，第二罐中投入低N的生产培养基。细胞生长速度达6.3mg（干重）/L.h。,（4）固定化培养法,固定化培养法是先将植物细胞固定在特制的固定化反应器中，然后放入培养基中进行培养，或者连续流入新鲜的培养液进行连续培养，同时通往净化空气代替搅拌，最后收集培养产物的方法。 种类-网状多孔

39、板、尼龙网套、中孔纤维膜。 优点-细胞位置相对固定、易于获得高密度细胞群体、能够维持细胞间的物理化学梯度、有利于细胞组织化、易于控制培养条件、还有利于获得次级代谢产物。 实例-将辣椒细胞固定于聚氨基甲酸乙酯泡沫中，结果细胞生命力维持在23天以上。辣椒素产量较悬浮培养法高出1000倍。,（四）植物细胞种质保存技术,1、细胞种质保存的意义 （1）植物细胞在继代培养过程中常常导致染色体突变和基因型变异等现象，致使细胞失去全能性和某些有益性状，为此有必要对种质加以保存。 （2）自然界中多种植物濒于灭绝，需要建立人工种质库。 2、细胞种质的常规保存方法 （1）干燥保存法（2）液体石蜡覆盖法 （3）低温保

40、存法（4）低压低氧保存法 以上方法都属于常规保存方法，其原理主要是通过脱水、减少氧气供应、降低温度、抑制细胞生理活动、延缓细胞衰老等等手段来延长保存时间。其缺点是难以完全抑制细胞的生命活动，被保存的细胞仍然会发生遗传性变异。 3、超低温冷冻保存技术,3、超低温冷冻保存法,这是保存植物细胞的最佳方法，将植物种质细胞保存在-196的液氮之中。在这样的温度条件下，细胞的代谢与生长完全停止，也就还会引起遗传性状发生变异。 目前，植物的愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、花粉、花粉胚、体细胞、胚状体、茎尖分生组织、小植株、茎芽等等组织均已经在液氮中保存成功。 超低温冷冻保存的具体步骤如下： （1）冰冻保护

41、剂 （2）材料预处理 （3）降温与冻结 （4）细胞复苏 （5）深冻细胞的活力和存活率测定,（1）冰冻保护剂,常用的冰冻保护剂有：二甲亚砜（DMSO）、甘油、聚乙二醇（PEG）、葡萄糖、山梨糖、蔗糖等等。 几种冰冻保护剂复合之后的保存效果要比单一成份的保存效果好。 例如：单用5-10%的DMSO保存长春花培养细胞，其存活率为5-8%。而采用5%DMSO+1mol/L山梨醇复合液保存长春花培养细胞，其存活率为61.6%。,（2）材料预处理,取材就尽量安排在冬季，取材时应选择抗冻能力强的幼龄培养细胞。 实验材料应进行低温预处理： A、将材料在含有山梨糖醇+脱落酸的培养基中预培养，以诱导其抗寒能力。

42、B、将细胞在5-10%的DMSO培养液中，于0预处理1小时，以提高细胞存活率。,（3）降温与冻结,A、快速冰冻法-将那些经过-3到-10预处理20天的细胞培养物和其它材料一起，直接投入到液氮之中，令细胞迅速度过-10到-140之间的崩解危险期，冻结后的细胞呈玻璃态，冰晶不再生长，从而使得细胞不会被破坏。此方法多用于保存种子、花粉、球茎、块根、冬芽等高度脱水材料。 B、慢速冰冻法-是指将材料按每分钟下降1到10的降温速度进行慢速冰冻。此法适用于保存那些不耐寒的植物。 C、二步冰冻法-将植物先通过慢速降温至-30到-50，等达到一定程度的保护性脱水之后，再投入液氮之中迅速冰冻。此法适用于保存长春花

43、、人参、烟草、胡萝卜等悬浮培养细胞和愈伤组织。,（4）细胞复苏,细胞复苏也称为细胞化冻过程，大多数材料均采用快速化冻方法，只有木本植物的冬芽需要采用慢速化冻方法。 可分为二种不同的方法。 A、快速化冻-将冻块放置在35-40的环境下直接融化，称为快速化冻。 B、室温慢速化冻-先将冻块放置在0的环境中，然后逐步升高温度，使其融化，称为慢速化冻。,（5）深冻细胞的活力和存活率测定,A、再培养法-将复苏后的细胞接种于新鲜培养基上进行再培养，同时测定细胞的增值量、愈伤组织形成情况、和细胞分化为新植株的能力。再培养法是检查细胞活力的根本方法。 B、二醋酸荧光素染色法： 方法-采用1滴0.1%的荧光至少染

44、料溶液+1滴化冻之后的细胞悬混液进行混合。由于活细胞能够染色、而死细胞则不着色，采用普通显微镜计录细胞总数。再用紫外显微镜计录发出荧光的活细胞数。求百分比计算出细胞的存活率。 缺点-只能够作为生活力的预测指标，而不能代替再培养法。 C、氯化三苯四氮唑还原法（TTC法）： 原理-活细胞内含有脱氢酶，能够将氯化三苯四氮唑还原为红色物质formazan，而此物质只溶于乙醇、而不溶于水。 方法-将氯化三苯四氮唑+冻存的植物细胞进行保温反应，然后用乙醇抽提。再用分光光度法测定其吸光度。 缺点-只能够作为生活力的预测指标，而不能代替再培养法。,（五）植物细胞突变体筛选技术,1、筛选的目的-利用植物细胞培养

45、技术筛选发生突变的细胞、或者筛选突变细胞无性系，可获得药物高产细胞株、或者获得针对某些中间物质进行转化的高产酶细胞株。 2、细胞突变的原理-细胞突变通常是指DNA一级结构上发生永久的、并且是能够遗传的变化。突变的主要原因是在于染色体缺失、重复、倒位、易位、碱基顺序转换、颠换、移码等等因素引起。植物细胞在人工培养中常常发生自发突变，如在悬浮培养中，其突变频率在10-710-6之间，远远高于在自然界中突变频率。人工诱变技术能够促使细胞发生突变。 3、人工诱变方法 （1）物理诱变方法-紫外线、r-射线、X-射线。 （2）化学诱变方法碱基类似物-5溴甲嘧啶、2氨基嘌呤、马来酰胺。烷化剂-甲基磺酸乙酯、

46、硫酸二乙酯、乙烯亚胺。抗生素-丝裂霉素、链霉素。 4、细胞突变体的筛选原则和方法,4、细胞突变体的筛选原则和方法,（1）筛选原则-主要是根据细胞表现型的变化来进行筛选，而不是遗传学上定义的DNA结构变化、染色体变化来作为依据。 （2）直接筛选法-利用在选择性培养基中，细胞突变体可以优先生长的特性进行选择的方法，称直接筛选法。 A正选择法-植物细胞的培养基中含有特定物质如病原病毒、盐类、抗生素、代谢抑制物、除草剂等选择性成份，结果使得正常细胞死亡，而只有突变体细胞才能分裂繁殖，借以获得突变体细胞，称正选择法。 B负选择法-在特定的选择性培养基中，首先使得正常细胞生长繁殖，而突变体细胞则受到抑制、

47、使其呈休眠状态，然后使用淘汰剂如砷酸氢钠、5-溴脱氧尿嘧啶等物质使得正常表型细胞死亡，而未中毒的突变型细胞则通过调整培养基成份的方法，使基恢复正常生长，最终获得突变体细胞，称负选择法。 （3）间接筛选法-正常的植物细胞中含有硝酸还原酶，该酶既能还原硝酸盐，又能还原氯酸盐。而突变后的硝酸还原酶缺陷型细胞则不具备这种能力。在培养基中加入氯酸盐，氯酸盐在硝酸还原酶的作用下在细胞内生成次氯酸。次氯酸则对细胞有毒害作用，可杀死含有硝酸还原酶的正常细胞。突变之后的硝酸还原酶缺陷型细胞由于细胞内不会形成次氯酸，则可以继续生长繁殖。,（六）植物原生质体培养技术,1、原生质体以及制备步骤 2、原生质体的培养 3

48、、原生质体培养的意义,1、原生质体及其制备步骤,原生质体-去除细胞壁之后的，仍然具有生命活力的裸体植物细胞，称为原生质体。原生质体也具有结构和功能的全能性。原生质体经过诱变，也能产生突变体细胞。 原生质体的制备步骤： （1）材料来源 （2）材料预处理 （3）制备原生质体所需要的酶类 （4）原生质体的分离 （5）原生质体的纯化 （6）原生质体的活力测定,（1）材料来源,植物的各种组织器官均可以作为原生质体的材料。首先选用叶片、愈伤组织、悬浮培养细胞。其次选用茎尖、根尖、子叶、胚性组织细胞。 叶片-取材方便，遗传性一致，但是培养条件较为苛刻。 悬浮培养细胞-培养条件容易控制、实验重复性好，但是易产

49、生染色体倍性变异。,（2）材料预处理,预处理的目的-为了减轻对于原生质体膜的损伤，提高原生质体的获得率。 预处理的原理-通过物理化学方法，来改变细胞的生理状态和细胞壁的化学成份。使其容易进行质壁分离。 预处理的方法-共有5种方法： （A）质壁预分离 将愈伤组织或悬浮培养细胞置于17-20酶液中静置半小时，再于28-34保温，可达到质壁分离的目的。 将材料置于相同浓度的酶液+糖液之中，预培养1小时左右，再浸于酶液中消化，可达到质壁分离的目的。 （B）预培养-将除去表皮的叶片于诱导愈伤组织培养基上培养7天，再用酶消化脱壁，可使得质壁分离频率较高。 （C）暗处理-将室温下生长5-7个星期的植物材料于

50、黑暗中放置30小时以上，取其叶片所制备的原生质体具有较高活力。 （D）光处理-将叶片于日光或者灯光下照射2-6小时，令其萎蔫，然后取其叶片所制备的原生质体，具有较高活力。 （E）低温处理-萌动的种子在4下过夜，然后再播种，再从其植株的叶片上分离出的原生质体，具有较高的活力。,（3）制备原生质体所需要的酶类,纤维素酶-Onozuka R-10、RS、EA3-867。 果胶酶（又称离析酶） -Macerozyme R-10、Pectalyase Y-23。 崩溃酶-Driselase 半纤维素酶-Rhozyme HP150 蜗牛酶 以上酶类，在进行酶液配制时，需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、C

51、aCl2-2H20、KH2PO4等渗透稳定剂，以维持原生质体的完整性。 所配制的酶液，其PH值应维持在5.4-5.6为宜，降至4.8以下则原生质体就会发生破裂。 酶液配制之后不能进行加热灭菌法操作，而应该采用0.45um的微孔滤膜过滤灭菌。,（4）原生质体的分离,（A）机械法分离-产量较低。 （B）一步酶消化法-将材料在21-28之间，用纤维素酶+果胶酶温合液一次性处理224小时。 （C）二步酶消化法-先用果胶酶来降解细胞间胶层、获得单细胞，再用纤维素酶脱壁而释放出原生质体。,（5）原生质体的纯化,酶消化后的原生质体含有多种杂物，如叶脉、表皮、各种细胞器。需要进行纯化操作。 原生质体纯化方法有

52、4种： （A）离心法-原生质体混合物用500-1000r/min离心5min，吸去上层液，沉淀物用酶消化液反复洗涤3-4次，最后用原生质体培养液洗涤即可。 （B）飘浮法-采用20%的蔗糖溶液进行离心，结果原生质体飘浮在上层，而碎片及老细胞则沉降到底部，从而实现纯化。其缺点是产量低，并且容易对原生质造成损伤。 （C）界面法-将原生质体混合物置于葡聚糖+PEG混合液中离心，即可从两相的界面上获得高纯度的原生质体。 （D）滴洗法-将原生质体混合液置于孔径8um的滤器之中，用洗液以12滴/秒的速度自然过滤洗涤，洗至一定程度之后，收集残留物用原生质体培养液混合，此法的优点是原生质体破碎率较小。,（6）原

53、生质体的活力测定,（A）形态判断法-显微镜下原生质体呈现园而鼓、胞内的原生质环流和布朗运动活跃者，属于活的原生质体。 （B）活体染色法-用0.1%的酚红、伊文思蓝染色，不着色者为活性的原生质体，染色者为无活力的原生质体。 （C）荧光染料活体染色法-采用双醋酸荧光素进行染色，由于该染料可自由透过细胞膜，在具有活性的细胞内。被酯酶水解成荧光素而产生出荧光。而无活性的原生质体由于酯酶失去作用而不能产生出荧光素。最后可以根据荧光的强度就可判断原生质体的活力。,2、原生质体的培养,（1）培养方法 （2）培养条件 （3）细胞壁再生及细胞分裂 （4）愈伤组织再生及胚状体形成 （5）植株再生 （6）根的分化与

54、形成,（1）培养方法,（A）固体培养法-又称平板培养法，将含有1.2%琼脂的原生质体培养基冷却至45，然后再与等量的原生质体悬浮液混合，倾入培养皿中，冷却后用蜡封口，用于培养。 （B）液体浅层培养法-将1ml的原生质体悬浮液置于直径4cm培养皿、或者置于25ml的三角烧瓶中，使其成薄层之后于培养箱中培养，初期振摇1-2次，防止粘壁。 （C）液体悬滴培养法-将原生质体悬液滴入培养皿盖内，其用量分别为5-10ul、50-100ul、100-200ul，保持一定滴距，然后将皿盖置于培养皿上，并放在培养箱中培养。 （D）液体双层培养法-先将固体培养基倾入培养皿中冷却成层，再将原生质体悬浮液置于已经固化

55、的培养基是进行培养。 （E）液体看护培养法-在培养皿底层铺上一层正常密度的、并且已经经过射线处理、已经失去分裂能力、但是仍然具有代谢活力的原生质体混合物作为饲养层，再于其上接种一层低密度的原生质体悬浮液（5-10个细胞/ml）进行培养。,（2）培养条件,接种密度应适宜，密度过低则生长速度太慢，过高则由于营养物不足、或者由于代谢物浓度过大而抑制生长。 （A）平板培养时接种量为103104个/ml （B）液体培养时为104105个/ml 培养温度多为25-28。 培养的光照条件应根据实际情况灵活掌握。,（3）细胞壁再生及细胞分裂,原生质体在经过1-3天培养就可以再生新和细胞壁。 检查细胞壁的存在可

56、采用： （A）用0.1%ST染色，有细胞壁者在荧光显微镜下发出蓝色荧光。无细胞壁者则不发也荧光。 （B）用0.1%WBL型荧光增白剂染色，有细胞壁者在荧光显微镜下发出绿色荧光。无细胞壁者则不发也荧光。,（4）愈伤组织再生及胚状体形成,当培养的原生质体开始细胞分裂时，常常由三条后继通路。 （A）形成细胞团-继而发育成愈伤组织 （B）形成胚状体-再产生植株 （C）形成愈伤组织-再形成胚状体 在进行愈伤组织培养时，为了促进小细胞团和愈伤组织的生长，当培养至3-4周时，应该添辊一定量的含低渗稳定剂的新鲜的原生质体培养基。,（5）植株再生,当愈伤组织达到1-2mm时，应该及时将其转移到分化培养基上诱导器

57、官分化。 分化培养基与原生质体培养基的差别： （A）分化培养基只用蔗糖作为碳源，并且不加渗透稳定剂. （B）在分化培养剂中，细胞分裂素的浓度高于生长素. （C）在进行分化培养时，一般采用1500LX左右的光照. （D）在进行分化培养时，昼夜之间应该形成一定的温差。,（6）根的分化与形成,分化培养基上所形成的苗通常为无根苗，需要转移至诱导生根的培养基上进行生根培养。 生根培养基只含低浓度的生长素，不含分裂素。 无根苗一旦生根之后，就能够发育成完整的植株。,3、原生质体培养的意义,（1）植物细胞原生质体制备技术，为实现植物细胞超性杂交，创造新物种提供了有力的手段。 （2）在基因工程中，经过重组的质

58、粒，如果以原生质体作为宿主，则重组质粒更容易转化成功。 （3）原生质体在培养过程中能够发生更高程度的自发突变，也容易进行人工诱变。 （4）由于原生质体体积小，培养后分裂频率较高，并且不易为正常细胞所掩盖。,（七）植物细胞融合技术,1、定义-在外界因素作用下，令二个或者二个以上的植物细胞合并成一个多核细胞的过程，称为植物细胞融合技术。 2、实质-由于植物细胞具有细胞壁，不能直接融合，需要用酶除去细胞壁释放出原生质体之后才能进行细胞融合操作，因此植物细胞的融合实际上是原生质体的融合。 3、特点和意义 （1）可实现远缘杂交，获得种间杂种。 （2）可获得非整倍体杂种。 （3）一次就可以实现二个以上亲本的融合作用。 （4）可获得同时呈现双亲个体基因型总和的杂种。 （5）能够在有性生殖障碍的植物之间形成种间杂交。 4、促融因