内生固氮菌HAUM10对水稻的侵染定殖规律及促生效应

1、内生固氮菌HAUM10对水稻的侵染定殖规律及促生效应摘要：试验以从表面灭菌的稗草中分离到的一株内生固氮菌为对象，研究发现该菌具有较强的产固氮酶和吲哚乙酸能力。乙炔还原法测定其所产固氮酶的活性为 （），液相色谱法测定其产吲哚乙酸量为 。将用基因标记后接种水稻，观察其在水稻中的侵染定殖规律，发现在接种后第7天，标记的主要定殖于根内通气组织和韧皮部细胞，少量定殖在叶鞘中。盆栽试验表明，促进水稻叶绿素合成，有利于光合作用，在水稻生长后期促进氮、磷元素由叶向穗转移。关键词：内生固氮菌；水稻；侵染；定殖；促生infection and colonization of endophytic diazotro

2、ph haum10 on rice seedlingsand its plant growth-promoting role ， ， （ ， ， ， ）： a and it （） （） determine the which was detected as /l the 7th day ； while a few was the ： ； ； ； ； 水稻生长过程除了需要大量的水外，氮源是其最重要的生长因子。中国是世界上稻米的主要生产国和消费国之一，目前化肥是实现单位面积高产的重要因素之一，但中国占世界约的耕地面积中施用的氮肥高达全球氮肥总用量的以上。氮肥进入灌溉稻田后，通过氨的挥发、硝化反硝化

3、作用、表面流失等多途径损失，最终导致氮肥利用率降低。大量氮素损失导致一系列环境问题：地下水污染和江河湖泊的富营养化；饮用水中硝酸盐浓度高于 将导致婴儿高铁血红蛋白症和成人胃癌；和的排放可能导致全球气候变暖。生物固氮不仅可以为植物提供氮源缓解施用化肥带来的一系列危害，而且具有环保、高效、节能、高效等优点，因此研究利用生物固氮的方式为水稻提供氮源具有极其重要的意义。植物内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，被感染的宿主植物不表现出外在症状，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物的方法来证明其内生性。内生菌对宿主植

4、物的促生效应包括固氮、解磷、分泌植物激素、促进矿质元素吸收、生物防治等。植物内生固氮菌（ ）是一类能定殖在健康植物体内，与宿主植物进行联合固氮的微生物。由于内生固氮菌在农作物体内不仅具有固氮活性，而且可能分泌植物激素等多种生物活性物质促进作物生长，因此，利用内生固氮菌对植物的促生效应，有可能开辟一条不同于根瘤菌与豆科作物互作促生的途径。考虑到与水稻生长环境相似、常与水稻发生营养竞争关系的稗草中可能存在某些有促生作用的内生固氮菌，故将稗草作为内生固氮菌分离的材料，研究了其中一株内生固氮菌在水稻中的侵染定殖规律及对水稻的促生效应。 材料与方法 材料内生固氮菌来源：由华中农业大学微生物学国家重点实验

5、室自华中农业大学实验基地的稻田沟渠稗草中分离得到。单个菌体短杆状，不形成芽孢，具有运动性，革兰氏阴性。在营养琼脂平板上生长，单个菌落平滑，菌落淡黄色，半透明，中间凸起，粘着于培养基上；在无氮阿须贝氏培养基平板上，菌落透明黏稠，边缘不规则向周围扩展生长。根据的生理生化性质和 序列比对结果，鉴定是一株泛菌（ ）。含基因的供体菌：大肠杆菌（ ），卡那霉素抗性。由比利时鲁汶大学 教授馈赠。三亲本杂交辅助菌： （， ）。 方法 扩增固氮酶基因，测定固氮酶活性 首先用碱变性法抽提haum10总，并稀释100倍后作为模板。固氮酶基因扩增引物和反应程序参考等的方法。产物经琼脂糖凝胶电泳后用纯化试剂盒回收，回收

6、产物连接到载体上，转化入，挑阳性克隆测序。乙炔还原法测纯培养的内生固氮菌所产固氮酶活性。将改良的氏培养基 分装于瓶中灭菌后制成斜面，取等量内生固氮菌接种于氏培养基， 培养 后将瓶上的硅胶盖换成不透气的橡胶塞。用注射器平衡瓶内外压力后，抽出体积的空气，注入等体积的乙炔，继续在 下培养 。气相色谱仪测定乙烯生成量。 产吲哚乙酸试验 培养基：葡萄糖 ，甘露糖 ，苹果酸 ， ，去离子水 ， ，加色氨酸 。接种菌体于培养基中，生长周； 离心 ，收集上清液；调节上清液为；用等体积的乙酸乙酯抽提3遍；提取物 水浴旋转蒸发真空浓缩至近干，然后加 无水乙醇悬浮；检测：采用色谱柱，甲醇醋酸水为流动相，流速 ， 。

7、 基因标记及接合子的鉴定 以抗生素利福平作为三亲本杂交试验受体菌的筛选标记，驯化，得到抗 的。三亲本杂交方法参考赵斌等的方法。为了得到稳定表达的接合子，将三抗平板上得到的接合子菌体在无抗性的液体培养基中传20代，然后将菌液稀释倍涂三抗（ ， ， ）平板，即可得到较为稳定的接合子。鉴定转化子：在荧光显微镜下观察菌体是否发出绿色荧光，是否在三抗阿须贝氏培养基上生长；扩增菌体基因：挑转化子于三抗培养基生长至对数期后，取菌液 ， 离心 ，倒掉上清液加入 无菌去离子水并摇动均匀， 、 后置冰上， 离心 ，取 上清液作为模板。引物的设计：从中搜索到基因的序列，根据基因全长设计引物。为，为。反应体系（ ）：

8、 ；（、和浓度均为 ） ；正反向引物（ ）各 ；模板（ /ml） ；聚合酶（ ） ；加水至 。反应程序： ，预变性 ； 变性 ， 退火 ， 延伸 ，个循环； 继续延伸 。 在水稻中的侵染定植路径 水稻（中花）种子表面灭菌处理参考文献的方法。将灭菌后的水稻种子铺于琼脂固体培养基中萌发 ，选择健壮的幼苗剪少许根后移入 装有水稻无氮营养液配置的半固体培养基（琼脂浓度 ）的玻璃试管（口径 ，长 ）中。接入无菌水悬浮的。管底作避光处理后，置智能光照培养箱（光照 ， /d；黑暗 ， /d）培养。于接种后、 分别取水稻幼苗，无菌水洗去表面附着菌体。在连续变倍体式显微镜下用不锈钢刀片切取水稻组织制作切片。激光

9、扫描共聚焦显微镜激发光下观察水稻各部位内生固氮菌存在状态。 纤维素酶和果胶酶试验 纤维素酶试验采用赵斌等的纤维素水解试验方法一。配制果胶培养基， 灭菌 倒平板，每个平板点种株菌株， 倒置培养 。 盆栽试验观察对水稻生长的影响 盆栽试验设不接种（）和接种两种处理，各个重复，每个重复盆（盆口径 ，高.0 ，土深.0 ）。水稻种子表面灭菌后，置于添加无菌水的平皿中， 萌发 后，倒掉无菌水，加入无菌水悬浮的菌液浸苗过夜。每盆棵苗，等距种植。水稻生长过程浇自来水和无氮营养液。待水稻生长至分蘖期和灌浆期再各接种一次内生固氮菌剂。移栽后分别在第、天取样，将植株完全拔出后自来水冲洗干净。观察内生固氮菌在水稻不

10、同部位的消长动态，不同时期测在水稻体内的固氮酶活性。移栽后第天取水稻苗测叶片的叶绿素含量。第天和种子收获期取样消化后以凯氏定氮法和钼锑抗比色法分别测水稻氮和磷含量。 结果与分析 固氮酶基因及固氮酶活性基因是蛋白酶多肽的个功能基因之一，扩增片段大小为 （图）。测序结果在数据库中经比对，与成团泛菌（ ）的序列覆盖率为，同一性为。乙炔还原法测定的固氮酶活性为 （）。 产吲哚乙酸试验结果分析高效液相色谱法测定吲哚乙酸标准品的出峰时间是 （图），确定发酵液出峰时间为 的峰图是其所产吲哚乙酸的峰图（图），可得产吲哚乙酸量为 。 标记菌株的鉴定与供体菌、辅助菌接合后，在选择性三抗培养基上产生了一些接合子，而

11、单独的供体菌、辅助菌、受体菌在这样的选择性培养基上均不能生长。将其接种于无氮三抗培养基上，接合子可生长，单独的供体菌、辅助菌、受体菌不生长。用无选择压力的液体培养基传20代后，在三抗培养基上筛选稳定的接合子，此时在荧光显微镜蓝色激发光下明显看到每个单菌落发出明亮的荧光。挑取稳定表达的接合子单菌落液体培养后取菌液，扩增片段，琼脂糖凝胶电泳结果见图。从图3可以看出，经扩增后，和阳性对照 都产生了分子量相同的惟一一条电泳带（片段大小约 ），而野生型的未产生任何条带。 在水稻中的侵染定殖试验发现，水稻苗接菌后，在水稻根周围 内可见云雾状细菌群围绕，说明haum10主要通过根部侵染进入稻体，而在未接菌的

12、水稻根的周围没有此现象。激光扫描共聚焦显微镜观察未接菌对照的水稻根，横切面内没有绿色荧光标记的菌体侵染定殖（图）。接种后第3天，用普通荧光显微镜观察发现水稻根毛区聚集大量内生固氮菌，附着于根表面（图）。第5天，激光扫描共聚焦显微镜观察发现水稻表皮细胞和皮层细胞有少量标记的。第7天，根内数量增多，内生固氮菌主要分布于皮层细胞和韧皮部细胞，当薄壁细胞萎缩径向壁相互重叠形成通气腔后，在通气组织中可看到haum10（图）；在叶鞘横切面和纵切面也可见较多的，主要存在于韧皮部细胞和薄壁组织中（图和图）。试验发现，在维管束中有极少量基因标记的菌体。 所产纤维素酶和果胶酶的活性接种两周后观察分解纤维素的试验结

13、果，发现接种的滤纸条比未接菌对照滤纸条变薄。根据纤维素分解菌具有将纤维滤纸分解使其失去原有物理性状的性质，说明它可以产生纤维素酶分解纤维素。在果胶培养基上培养后，在菌体生长区域培养基颜色由黄色变为蓝色（培养基中添加了酸碱指示剂），且菌落周围的培养基出现下凹（图）。根据果胶可以使液体培养基胨化，果胶被分解，胨状培养基被液化，培养基表面会出现下凹的原理，说明在生长过程中能够分泌果胶酶。 盆栽试验结果分析通过盆栽试验，观察在水稻不同部位的消长动态，在接种后第7天水稻根、茎、叶内都已经有haum10侵染定殖。接种后第7天时，水稻鲜根、茎、叶菌体数量分别为、 ；第天，水稻鲜根、茎、叶菌体数量分别是、 ；

14、第天，水稻鲜根、茎、叶菌体数量分别是、 ，第天，水稻鲜根、茎、叶菌体数量分别是、 。在水稻体内迁移路径是从根到茎再到叶，菌量表现为根茎叶。第7天测得在水稻鲜根的固氮酶活性为 （），第天为 （），第天为 （），第天为 （），第天为 （）。接种第天后水稻鲜叶叶绿素含量和总叶绿素含量分别为和 ，分别比对照增长和；地上部分、地下部分全氮含量分别为、 ，分别比对照增长、，全磷含量分别为、 ，分别比对照增长、；收获期水稻叶片接种的全氮、全磷含量分别为、 ，分别比对照下降、（表）。 讨论内生细菌通过黏附作用吸附在植物细胞的表面，这对细菌侵染定殖有很好的促进作用。试验中发现水稻根毛区聚集较多的，附着于根上。大

15、多数内生菌都具有分解纤维素和果胶的能力，有助于其穿透植物细胞壁，进入植物体内部。同样，对进行的研究发现其果胶分解能力比较强。运动性试验说明可能具有鞭毛，这有利于其发挥主动运动性，向有利于其生存的环境移动，同时可以开辟更广阔的生存空间。显微切片发现主要定殖于根和叶鞘的皮层细胞和韧皮部细胞，可能这些部位细胞有利于其生存。等利用免疫金标记技术研究发现，固氮型内生菌粘质沙雷氏菌（ ）可以定殖于水稻根、茎、叶中，在细胞间隙、衰老根的皮层细胞、通气组织和木质部导管中有大量该菌定殖。等利用标记克雷伯氏产酸菌（ ），通过组织染色发现新生侧根处极有可能是该菌侵染进入水稻根内的主要部位。高效液相色谱法分析产吲哚乙

16、酸的情况，由色谱图可知能分泌吲哚乙酸，而且还有其他许多未知物质产生，某些物质的分泌量比吲哚乙酸多。这些未知物质可能是其他植物激素，对宿主植物有促生作用或有助于植物进行无机盐运输、营养分配等。可分泌生长激素，可能在植物体内也通过分泌植物激素的方式对宿主起促生作用。可促进水稻根的伸长，增加根系与土壤接触面积，从而有利于吸收环境中的营养物质，如矿质元素和水，最终增加植物的生物量。等用 接种水稻，认为 可产生吲哚乙酸，使植株侧根和根毛增多。盆栽试验是在水稻种子萌发 后接种，是因为在萌发时接种有助于该菌充分与水稻根接触，达到促根目的，使根系强大，为培育壮秧打下坚实基础；另外，有助于该菌占领根系，排除盆栽

17、外环境中其他杂菌的干扰。对收获期水稻叶中氮、磷含量分析发现，接种的水稻叶中氮、磷含量均比未接菌水稻叶中氮、磷含量低，分析可能是在水稻生长后期对营养物质由叶运输至穗发挥了一定的作用。沈德龙等利用同位素标记技术研究了水稻内生成团泛菌在水稻子粒乳熟初期和乳熟后期对光合产物在源、库中的分配和影响，发现水稻内生成团泛菌可以调控光合产物在旗叶（源）、穗（库）中的分配，在水稻子粒乳熟初期，喷施菌液有助于旗叶光合产物向穗的运输，而向根、叶鞘运输的光合产物很少，在乳熟后期则有抑制作用，原因是与菌株产生的激素有关。综上所述，可以判断从稗草中分离的可以侵染定植于水稻中，这是其促生性质被广泛利用的基础。对水稻的促生效应包括固氮、产生生长激素、有助于水稻叶绿素合成促进光合作用以及水稻生长后期氮、磷元素由叶向穗转移。参考文献： 张瑞丹 滥用的化肥：中国占全球的耕地 消耗的氮肥：， 张启发绿色超级稻的构想与实践北京：科学出版社， ， ， ， ，（）： ， ?魱 m ，（）： ， ， ， m m，（）： 赵 斌