培养细胞的生长增殖过程.ppt

1、培养细胞的生长增殖过程，第4节，体外培养细胞的生长增殖过程，原代培养基：在体内从组织接种培养到原代培养持续1-4周。在这个阶段，细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。前大气：原代培养的细胞经过一代后被称为细胞系。细胞增殖旺盛，转移10 50次后细胞增殖缓慢，完全停止。衰退期：细胞增殖缓慢或不增殖。细胞轮廓增强，最终衰退，枯萎。1 .初级培养期：也称为第一代培养。也就是说，从体内取出组织接种培养，持续到第一代，通常持续1，4周。这次细胞表现出活跃的运动，可见细胞分裂了，但不旺盛。第一代培养细胞和体内援助职在形态结构和功能活动上有很大的相似性。细胞群是异质的。也就是说，每个细胞的遗传性质徐璐不同，细

2、胞相互依存性强。将这组细胞稀释为单细胞，在柔软的琼脂培养基上培养时，细胞克隆形成率(Cloning Efficiency)很低，因此细胞独立生存性下降。克隆形成率是细胞群稀释后分散成单个细胞培养时形成细胞小组(克隆)的比率。第一代培养细胞大部分是二倍体核型。由于原代培养细胞和体内细胞性的相似性大，因此是药物检查的好实验对象。第二代早期培养细胞世代相传，然后转变为细胞株。在整个寿命期间，此期间的持续时间最长。如果培养条件比较好，细胞可以增殖旺盛，维持二倍体核型，二倍体核型细胞称为二倍体细胞株。为了保持二倍体细胞的性质，细胞必须在第一代培养基或传代后早期冷冻。目前世界上常用的细胞都在10代内冷冻保

3、存不了。如果不冷冻，为了生存，为了维持细胞的适当密度，必须反复继承。但是，这可能导致细胞失去二倍体性质或发生变异。一般来说，继承1050次左右，细胞增殖逐渐减慢，完全停止，细胞进入第三期。，在细胞寿命阶段，很少见，但在上述三个时期中的任何一个时间(大末期或衰退期经常发生)，由于某种因素的影响，细胞可以自发转换(Spontaneous Transformation)。转化的标志之一是细胞能获得英产或恶性。细胞永生成也称为不死性，即细胞获得持续性增殖能力的细胞群也称为无限细胞株或连续细胞株(Continuous Cell Line)。无限细胞主义的形成主要发生在二期末期或二期开始阶段。细胞获得不死

4、性后，核型多为二倍体。细胞转换也可以用人工方法诱导，转换的细胞也可以具有恶性性质。细胞的生成和恶性是不同的性质。2培养法、阳性病培养法培养板培养法、A阳性病培养法、所谓阳性病培养法是将培养对象直接接种到培养瓶上，然后放入培养箱进行培养。(莎士比亚、阳性法、阳成法、阳成法、阳成法、阳成法、阳成法、阳成法)早期的培养瓶是玻璃培养瓶，现在主要使用一次性塑料培养瓶。与普通瓶子不同，使用的材料是透明的，对生物细胞无毒的材料。使用的玻璃大部分是硼硅酸盐玻璃。形状主要使用适合细胞附着生长和显微镜观察的平面形状。与此相关的一种方法是封面幻灯片培养瓶的培养。也就是说，使用复盖幻灯片作为生长表面，将要培养的组织和

5、细胞接种到复盖幻灯片上，然后放入培养瓶中进行培养。这样做具有以下优点：(1)培养瓶表面粗糙等原因可以避免对培养物的影响。(2)可以方便显微镜观察、染色等操作和永久保存。(3)增加了培养瓶的培养面积。b培养板培养法、培养板培养法一度被称为微量培养法，是现代体外培养技术中最常用的方法之一。具体方法是将培养细胞接种到培养板的孔内，然后在C02培养箱内培养。最常用的培养板是6孔、24孔、96孔培养板。通常是一次性的。三元代培养技术，流体比老龄更容易培养。尤其是胚胎组织。分化低，分化高，容易培养。肿瘤比正常组织更容易培养。所有动物细胞培养都是从初级培养开始的。原代培养分为两种：组织块培养法和组织消化培养

6、、原代培养、取材、分散细胞、接种、培养等所有工作中，要多注意维持培养物和生长环境的无菌条件。组织块培养，组织块的原代培养方法，首先从机体的一个部位取出组织的方法：处死动物，将组织块切成块，将Hanks液摔成剪刀片，加入35mLHanks，低速离心，扔掉清液，留下组织吸管，取出组织块，贴在培养基上的方法，以及贴在瓶壁上的方法对于某些软组织，如肿瘤、胚胎、大脑等，可以通过在人的注射器玻璃管中挤压组织碎片来分离。组织消化培养，1，采访分离和组织消化：将生化切断的组织分散到细胞团或单细胞。胰蛋白酶适合细胞间质较小的软组织。2.培养过程：处死动物-切下组织块，把汉斯液体用剪刀的碎片冲洗掉，吹打35 Ha

7、nks液体，扔掉低速离心力，清液，留下组织块：组织进行消化。-吸管取出组织液，放入培养瓶。、根据细胞生长的特性，传代方法有三种：1悬浮生长细胞传代离心法传代：离心(1000转/分)商城县、沉淀物、新培养液和混合代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁上时，清除上清培养液L2 1 23，然后用吸管直接吹，形成细胞显液，然后传给下一代。传代培养，2半悬浮生长细胞传代，这种细胞部分呈现壁生长现象，但没有附着在壁上，可以直接吹气，将细胞从瓶壁上脱落，转移。使用酶消化法代代相传。常用的消化液是0.25的胰蛋白酶溶液。三壁生长细胞传代、壁细胞细胞细胞在培养病成长为致密的单层后，仍没有足够的空间继续生长，培养基的

8、营养成分也消耗了很多，代谢废物也积累了很多，需要病培养，细胞要代代扩增。1 .首先用紫外线灯消毒超顺工作台20-30分钟。壁细胞传代-消化过程，2 .关闭超净工作台上的紫外线灯，打开酒精灯(所有工作在酒精灯火焰下进行)，3 .消毒的物品放在初顺工作台上。4 .将培养的hella细胞培养盘放入超净工作台上。5 .用无菌吸管将细胞现有的培养液吸干，扔掉培养液。6。将每个1毫升0.25%的胰酶消化液放在培养皿中，7 .将装有胰酶消化液的培养皿放到37温箱中，消化1分钟，8。从温箱中取出培养皿，然后用手轻拍培养皿的边缘。9 .用倒置显微镜观察细胞是否完全脱落，细胞是否完全皱巴巴，此时扔掉胰酶，放入培养

9、基后轻轻摇动，从细胞瓶壁上洗掉细胞，用吸管吹掉细胞弦液。有经验的话，可以通过肉眼观察壁半透明的细胞层来判断消化程度。10。细胞完全分离后，放入含有适量血清的培养基结束反应，过度消化会看到很多细胞脱落的胰酶溶液排出。在倒数第二、第三阶段，可以抛弃胰酶，继续作用到病中剩余的胰酶，直到最后阶段的消化程度，即使有点过了也不会产生太大影响。(David aser，Northern Exposure)。，刚放入胰酶时，细胞仍是致密的断层。，培养一段时间后，PH下降，培养液变黄。培养箱可以自动控制5%的含量。细胞数，培养的细胞在一般条件下必须有一定的密度，才能长得好，所以需要细胞数。计算结果以每毫升细胞数表

10、示。细胞数的原理和方法等于血细胞数。血细胞计数器：手动细胞计数计数器：用手动计数、程序、酒精冲洗计算板，在计算板上盖上盖子，轻轻移到一边，放入细胞显液。拿吸管，放入培养瓶，轻吹细胞显液，搅拌。从盖子边缘掉下细胞显液，填满了计算板和盖子之间的空隙。注意：不要让液体溢出盖子或起泡。镜子观测数：计算计算板方形的大单元数，压线器只计算左右上方，不计算左右下方。如下计算：细胞数/毫升原液=注意：镜像计数，有时由两个以上细胞组成的细胞团应计算为单个细胞。如果细胞团占10%以上，就表明消化不足。如果细胞数小于200/10平方毫米或大于500/10平方毫米，则表明稀释不适当，应在重新装入细胞显液后计算。细胞数

11、：准备细胞显液后，要计算包含的细胞数。通常以细胞数/毫升表示。用品：细胞悬浮，培养液，计算板。1，将血细胞计数板和盖子擦干净，将盖子盖在计算板上。2，吸一点细胞显液，将水滴放在盖子边缘，使显液充满盖子和计算板之间。请安静3，3分钟。4，镜下观察，计算板4大晶格细胞总数，压线细胞只在左右上方计算。然后计算如下：细胞数/ml4巨噬细胞数/410000注：如果在镜子上偶然看到由两个或更多细胞组成的细胞团，则必须计算为单个细胞。如果细胞团占10%以上，说明分散不好，需要重新准备细胞显液。计算方法：连根焦糖酶真的不能消化细胞吗？为什么？提示：胰蛋白酶不仅能消化细胞间蛋白质，而且长时间的作用也会消化细胞膜

12、蛋白质，对细胞造成损伤，所以要好好调节胰蛋白酶的消化时间。壁生长细胞传代摘要，加入消化液，分散的单细胞打倒消化液，加入培养液结束消化，细胞显液接种2 4个培养瓶生长，大部分动物细胞在离子培养条件下，必须附着在具有适当正电荷的固体或半固体表面，才能正常生长，最终从附着表面扩展到单层。壁培养的材料和系统，壁培养的表面要求纯阳电荷和高度的表面活性。如果是有机物表面，则必须具有亲水性和正电荷。主要材料是玻璃、塑料、金属、微载体。壁培养系统主要有回流、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等。回流培养系统的核心是用可摇动或转动的圆筒培养容器，使细胞能交替接触培养液和空气。但是该系统有表面积有限，培养条件检查有限，

13、劳动强度高，占用空间大等不足。班维兹尔开发的微载体培养系统在一定程度上克服了这种缺陷。微载体培养动物细胞是一种非常有价值的培养技术，适用于大规模生产动物细胞生物产品，附着在墙上生长的细胞的生长特性，原先是圆形的细胞一贴在墙上就迅速展开，开始有丝分裂，很快进入大规模生长期。通常几天后，可以铺上生长表面，形成致密的细胞断层。这种方法易于观察细胞的生长情况，适合于实验室研究。但是如果需要继续培养，就要重新分配和稀释单层细胞，再接种，世代培养。附着在墙上生长的细胞的一般生长过程，包括：(1)游离基：接种的细胞悬浮在培养液中，由于细胞质的收缩，各种形式的细胞开始变圆。(2)吸附期：细胞类型不同，附着时间

14、不同。单细胞，传代细胞较快，组织块，大细胞团较慢。一般来说，大部分细胞可以在24小时内贴墙，平均贴附时间约为5-20min。细胞状态不好、濒临灭绝的细胞、培养基偏酸、碱性、培养瓶脏等不利条件都对细胞标签不利。(3)繁殖期：圆形悬浮细胞贴在墙上，然后延伸到极性细胞，此时有细胞运动，但没有细胞分裂。停滞了一会儿，开始分裂。随着细胞数量的增加，细胞之间开始接触并连接成碎片，细胞的运动和分裂都停止了。细胞间接触引起抑制的这种现象称为接触性抑制。(4)退化期：细胞充满培养瓶壁，达到一定密度后，随着营养物质的消耗和代谢物的积累，细胞开始退化。细胞轮廓变强，细胞内堆积着膨胀的线粒体颗粒。如果不及时继承，细胞

15、会从病壁上脱落。壁培养的优点，(1)壁培养容易更换培养基。(2)为了提高细胞密度，容易采用灌注培养。(3)更有效地表达同一产品。(4)培养液和细胞比例容易调节。(5)容易观察细胞生长。思维测试问题多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境知识，思考和讨论以下问题。1.体外培养细胞时，应该提供什么物质？提示：充足的营养供应，适当的温度，适当的pH和气体环境。2.体外培养的细胞需要什么环境条件？提示：无菌、无毒的环境。侧围考试问题，3 .在进行动物细胞传代培养时，用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间物质主要是什么成分。胃蛋白酶可以吗？提示：用胰蛋白分散细胞表明细胞之间的物质主要是蛋白质。适合胃蛋白酶作用的pH值约为2，如果pH值大于6，胃蛋白酶就会失去活性。适合胰蛋白酶作用的环境pH为7.28.4。适合大部分动物细胞培养的pH为7.27.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，胰蛋白酶在此环境中活性高，因此胰蛋白酶适合细胞培养时消化。4 .为什么培养动物细胞时通常要添加血清？提示：