动物细胞培养基本技术与原理

1、第二章是动物细胞培养、细胞和组织培养的基本技术和原理：从体内取出组织或细胞，模拟体内生理条件，体外培养使其存活和生长。包括器官培养、组织培养和细胞培养三个方面，分别代表细胞水平、组织水平或器官水平培养，动物细胞培养的主要领域和意义，动物细胞培养的特点和动物细胞培养的生存条件。动物克隆的广泛应用。单克隆抗体技术与现代医学，单克隆抗体技术的步骤：*杂交瘤细胞与抗原刺激的B淋巴细胞融合，所述抗原由骨髓瘤细胞的特异性抗原免疫刺激。杂交瘤细胞的特征：*它可以像骨髓瘤细胞一样在体外无限增殖，并具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。单克隆抗体技术也称为杂交瘤技术。单克隆抗体的特点：*高特异性、敏感性和准确性应

2、用：临床医学中的疾病诊断。生产各种免疫疫苗。用于治疗一些肿瘤。用于各种基础医学研究。胚胎孵化与畜牧业、家畜胚胎移植：利用胚胎技术大量生产高质量胚胎，可以降低胚胎成本，扩大移植胚胎来源。体外受精：加速家畜改良品种的改良。利用体外受精技术进行核移植、性别控制和基因导入，可以工业化生产遗传性状稳定、性能优良的家畜。大规模动物细胞培养和现代医学、治疗性抗体和抗体药物4。动物克隆技术的有益应用及其应用前景：(1)优良动物物种的保存(2)濒危和珍贵动物的拯救(3)利用克隆动物工厂生产蛋白质药物(4)利用克隆技术生产人体器官(2)动物细胞在体内的特性，动物细胞在培养条件下的生长特性，动物细胞在培养条件下的生

3、理特性，1 .动物细胞的体内特性在体内，由动物细胞：分化的动物细胞具有明确的功能分工和明显的形态特征。例如，肌肉细胞呈纺锤形，从而行使收缩和伸展的功能；神经细胞有长的分支和许多纤维，以便接受和传递刺激；红细胞呈圆盘状，有利于与周围环境进行气体交换，并在血管中流动；上皮细胞经常相互挤压成不规则的形状，因为它们覆盖了表面。动物体内细胞按其分裂能力可分为三类：第一类是能维持其继续分裂能力并能继续分裂的细胞，如骨髓干细胞和各种前体细胞；第二类细胞群是永久丧失分裂能力的细胞，如各种高度特化的细胞；第三类是静态细胞群，即所谓的G0细胞。在正常情况下，它们不会分裂或合成脱氧核糖核酸，但在受到刺激后，它们会重

4、新进入细胞分裂。比如人类肝细胞。第一类和第三类细胞可以在适当的条件下进行体外培养。2.培养条件下动物细胞的生长特性。体外培养的动物细胞可分为：贴壁依赖型、非贴壁依赖型和兼性贴壁细胞；1)贴壁依赖细胞，包括成纤维细胞型、上皮细胞型、迁移细胞型和多形性细胞型。成纤维细胞的形态与体内成纤维细胞相似，细胞内呈梭形或不规则三角形，中心为圆形细胞核，细胞质中有23个不同长度的突起。细胞群通常连接成一个网，它们以放射状或火焰状生长。除了真正的成纤维细胞，心肌、平滑肌和成骨细胞在培养中都属于这种类型。游离细胞型在支持物上分散生长，但不连接成碎片。细胞胞质常伸出伪足或突起，表现出活跃的游走和变形运动，速度快，方

5、向不规则。在某些条件下，它可以转化成成纤维细胞型。多态细胞类型一些组织和细胞，如神经细胞，很难确定其稳定的形态，可归类为多态细胞类型。2)非附着依赖型也称为悬浮型，其可以在培养基中悬浮生长，而在培养过程中不附着于支持物。来源于血液和淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞属于这一类，并且细胞通常是圆形的。3)在兼性贴壁细胞的动物细胞培养中，有些细胞表现出双重性，既可以是贴壁生长，也可以是悬浮培养，如中国仓鼠卵巢细胞和小鼠L929细胞。动物细胞在培养条件下的生理特性1)动物细胞的分裂周期长，一般为1248小时。它不仅因细胞种类不同而不同，而且同一属不同部位的细胞所需时间也不同。此外，培养条件，如温度、酸碱度

6、、培养基成分等。也会影响分割周期的长度。2)接触抑制现象除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞需要附着在某些基质上(如玻璃、塑料等)。)生长，然后它们可以在拉伸后增殖。当细胞在基质上分裂增殖，并逐渐汇聚成碎片时，即当每个细胞与其周围的细胞接触时，细胞增殖停止，即细胞密度不再增加。这种现象被称为接触抑制或密度依赖性抑制。3)原代培养，有限细胞系和永久细胞系的动物细胞体外培养的起始物，继代培养后成为有限细胞系。即使有限细胞系的培养条件能够满足细胞繁殖和生长的要求，它们也只能存活有限的时间。一般来说，细胞在3050代后会逐渐死亡。世代：继代培养的数量和存活时间的长度随着细胞来源的年龄和种族而变化

7、。年龄越大，亚文化的数量越少。人胚胎成纤维细胞可培养约50代，而成人成纤维细胞不能传代培养50次。它们也是成纤维细胞。鸡胚成纤维细胞可以传代培养30代，而小鼠成纤维细胞只能培养8代。大多数细胞系在有限的几代内以恒定的形式增殖。经过有限的几代后，它们可能有两种情况：老化和死亡，并发展成永久细胞系或连续细胞系。从有限细胞系到永久细胞系的过渡期称为危机，转化过程称为动物细胞培养中的体外转化。永久细胞系具有以下特征：(1)细胞形态改变，如细胞变小，粘附减少，核质比增加；增长率增加，倍增时间缩短。对血清的依赖性降低；依从性下降；细胞的非整倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内后，癌症发生率增加。永久细胞系的

8、建立是大规模动物细胞培养的先导。(4)动物细胞的环境敏感性与微生物和植物细胞相比，培养动物细胞更加困难。主要原因是动物细胞只有细胞膜，没有细胞壁的保护。与动物相比，它们对培养环境非常敏感，所有影响细胞膜变形的因素都会影响动物细胞的存活。动物细胞培养对营养条件的要求也非常复杂。动物细胞的环境要求1。动物细胞培养的环境要求1。无污染环境。温度昆虫细胞培养的温度一般为2528。哺乳动物细胞培养的温度通常为37。一般来说，动物细胞比高温更能耐受低温。例如，哺乳动物细胞在45下只能存活1小时，但在25下仍能缓慢生长并长时间保持不朽。即使在4下几个小时后，细胞仍能在合适的温度下正常生长。液氮冷冻保存。3)

9、酸碱度动物细胞培养的适宜酸碱度一般为7.2-7.4，低于6.8或高于7.6，不利于细胞生长，严重时可导致细胞死亡。培养细胞的酸碱度要求与培养时间长短有关。通常，原代细胞有严格的要求，而永久细胞系对酸碱度有很强的耐受性，4)气体环境和溶解氧一般来说，细胞在培养初期需要较低的溶解氧水平，但在对数生长期或培养后期需要增加溶解氧水平。如果氧气供应不足，细胞会因缺氧而死亡。除了供氧，还应注意培养基中氧和CO2的平衡。渗透压动物细胞培养的渗透压包括两个问题：培养基的渗透压维持细胞内的渗透压。大多数动物细胞对渗透压有很强的耐受性。只要培养基的渗透压变化不太剧烈，一般不会对培养物造成致命的损害。平衡盐溶液通常

10、用于维持动物细胞的渗透压。4.动物细胞培养，基本概念和基本步骤。取样、分离和组织消化。细胞计数。细胞的常规检查。细胞系和克隆动物细胞的大规模培养细胞的冷冻保存和复苏。1.一般概念：细胞培养：将动物组织或细胞分散成单细胞，并使其在体外模拟的生长环境中继续生长和增殖的过程。原代培养是指将组织或细胞从体内取出进行原代培养的过程。原代培养细胞增殖约10代，称为原代细胞。传代培养(传代培养):转移培养是从原代培养的细胞延续而来，称为传代培养。传代细胞被称为传代细胞。从组织中提取材料，分离，消化(1)从组织中提取材料，原则上，各种动物组织都可以在体外培养，但事实上，年轻组织(尤其是胚胎组织)比老组织更容易

11、培养，而肿瘤组织比正常组织更容易培养。绘制材料前，应详细记录被摄单位的各种情况；所用器具在使用前应严格消毒灭菌，材料应在严格的无菌操作中取用。方法：在：中处死动物，取出组织块，放入小烧杯中，用尖鼻眼用剪刀剪成碎片(1毫米3)。用吸管吸取汉克斯溶液，冲洗剪刀上的碎片，加入35毫升汉克斯溶液，用吸管轻轻吹。低速离心，弃去上清液，留下组织块。(手术刀片也可用于切割组织块，具有对细小细胞损伤小、手术时间长、易污染等优点。对于一些软组织块，它们可以被放入注射器玻璃管中，或者被1毫米不锈钢/尼龙网筛挤压和分离。(2)组织消化通过生化方法将切割的组织块分散成细胞簇或单细胞。1.普通消化液的适用范围(1)胰蛋

12、白酶：适用于细胞间质少的软组织，如胚胎、羊膜、上皮、肝、肾、传代细胞等。(2)胶原酶：适用于纤维组织、上皮组织和癌组织。(3)其他酶类：链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶等。根据酶的作用特性和不同的组织成分适当选择。(4)乙二胺四乙酸：当最适合消化传代细胞时，常与胰蛋白酶一起使用。2.组织消化操作方法(1)胰蛋白酶消化将切好的组织块放入装有玻璃珠的三角瓶中，加入3050倍体积的0.25%胰蛋白酶；37.在水浴中消化3060分钟，每510分钟摇动一次。根据效果，去污溶液可以在中间更换。(静置10分钟，吸取2/3上清液，加入新鲜胰蛋白酶)用汉克斯溶液冲洗两次，每次23分钟；每次；以800转/分钟离心5分

13、钟，弃去上清液，加入营养液。如果有大块，可以用纱布过滤。如消化通道细胞，可以与乙二胺四乙酸混合。(2)胶原酶酶消化将15mm3的碎组织放入培养瓶中，加入5ml 2000 u/ml的胶原酶溶液，使最终浓度为200u/ml，pH6.5；36.5水浴持续2448小时，可适当延长，无需摇动。酶溶液在此期间可以更换一次；当组织块变软并分散在瓶底时，轻轻摇动使其分散成细胞簇或单细胞。小心倒出培养基，一些巨噬细胞可能会附着在瓶底，以便分离(单独培养或丢弃)；以800转/分钟离心5min，弃去上清液，重悬于牛血清白蛋白溶液中，再次重复离心；加入培养液制成细胞悬液用于接种。3.细胞计数计数悬浮液中细胞的形状和浓

14、度，以判断消化或稀释的程度(也用于检查培养基中细胞的浓度)染色：在干净的离心管中加入9滴细胞悬浮液，然后加入1滴0.4%台盼蓝，混合均匀，静置23分钟；填充细胞：在计数板盖板边缘加入12滴染色细胞悬液，使计数板与盖玻片之间的空间完全充满(无气泡或溢出)；计数：在显微镜下，在计数板的四个角上的四个大方格中记录活细胞(未染色细胞)的总数。一团细胞被一个细胞计数。压线单元格不是向上或向下计数，而是向左或向右计数。计算：细胞悬液浓度(细胞数/毫升)=(4个细胞/4)104倍稀释注：如果细胞团数超过10%，则意味着消化不充分。细胞接种浓度：310105/毫升。第四，一般培养方法(1)组织块培养方法将组织

15、块切成小片，直接放入培养瓶中。附着一段时间后，细胞从组织块中生长出来，最终形成单层细胞。1。点滴培养法最简单、最原始的培养方法点滴培养法的缺点：细胞生长空间狭窄，气体不足，培养基不能长期保存，容易液化，培养基的凹面载玻片需要经常更新，不便于观察。2。旋转管培养中的组织块或细胞可与营养液和空气交替接触，有利于细胞生长；培养管旋转缓慢，使整个管内壁充满细胞，提高了细胞产量，适合大量组织培养和各种长期传代培养细胞。缺点：在显微镜下很难观察。3.涉猎展位文化为大型文化系统提供了一个参考原则。卡尔斯伯格瓶培养法(如下所示):切割组织块并用牛血清白蛋白冲洗。转移到另一个培养皿中，在解剖显微镜下去除多余的组

16、织，如脂肪和坏死组织。组织块被切成1毫米3的小块。用预湿滴管转移至消毒离心管，静置使小组织块下沉，吸出上清液。用新鲜牛血清白蛋白冲洗。重复23次。转移到培养瓶中(每25毫升培养瓶中可放置2030片组织)，并吸出液体。加入1毫升生长培养基，轻轻摇动培养皿，使小组织块均匀分布。关闭瓶盖，在36.5培养1824小时。组织块粘附在瓶壁上35天后，加入5ml培养液。然后培养基每周更新一次。培养35周后，细胞持续生长，组织周围的生长呈晕状，称为“生长晕”。取出中心组织块，用预湿滴管将其转移到另一个新的培养瓶中。重复操作。将新鲜培养液换成原来的生长晕培养瓶。当生长的晕圈细胞扩散到培养瓶底面的约50%时，进行细胞培养。(2)单层法