木瓜蛋白酶的提取纯化实验报告

1、分离纯化爸爸蛋白一、目的(1)从未熟爸爸(Carica papaya )果实的乳汁中提取粗酶液，进一步纯化得到高纯度的木瓜蛋白酶。(2)通过本次实验，掌握了爸爸蛋白分离纯化的基本步骤和原理，了解了离心分离、提取等实验技术。二、原理爸爸蛋白(Papain )是巯基蛋白酶，它比胰蛋白水解作用酶催化剂多，能降解更广泛的蛋白基质。 也有脂肪酶活性。其分子量约为23000左右。 在25 、pH6.2下，1分钟生成1umol酪氨酸的酶催化剂量为1个单位。 爸爸蛋白是一条肽链，211氨基酸残馀化学基对折形成裂缝，酶催化剂分子只有一个巯基化学基，酶活力需要，活化剂有半胱氨酸、硫化物、亚硫酸盐和EDTA的阻化剂

2、，有重金属、羧基试剂、过氧化氢等巯基试剂干酪素是由爸爸蛋白分解生成的酪氨酸在紫外光区275nm具有吸收峰，通过测定275nm下的吸收值，可以判断爸爸蛋白的酶活力。 吸收值的大小与酪氨酸含量的多寡有关，吸收值大表示酪氨酸含量高，即爸爸因分解的干酪素多，酶活力高。三、实验材料爸爸果汁饮料PEG (聚乙烯管二醇，分子量6000 )； (NH4)2SO4三氯乙酸(TCA )； 酪氨酸； 考茅斯布里安特蓝四、仪器设备(1)离心机4000-1000rpm (冷冻式或非冷冻式)(2 ) 752紫外分光光度修正(3)水浴箱(4)冰箱(5)榨汁机五、玻璃器皿(以组为单位)试管(6)、100 mL烧杯(2)、吸管

3、(1)、玻璃棒(1)、试剂瓶(1000 mL、500 mL、250 mL等)、移液器或移液器5mL(1)六、实验试剂的制备及实验程序(1)酪氨酸的定标曲线试管号012345标准酪氨酸溶液(ml )00.20.40.60.81.0蒸馏水(毫升)21.81.61.41.21紫外吸光率A275nm纳米00.0660.1750.3000.4300.550将上述各管混炼，静置2分钟，测定各管A 275nm，制作定标曲线时，曲线如下(二)粗酶活性测定一种试剂(1 ) 3mg/ml的木瓜鸡蛋清酶液(0.1mol/L的磷酸缓冲液，用pH 7.2调制)(2)0. 1摩尔/升的磷酸缓冲液，pH 7.2(3)以0.

4、1 mol/l的磷酸缓冲液(ph 7.2 )制备含80mmol/L的半胱氨酸(4 )1%干酪素溶液：以0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 7.2 )制备(5 )15%三氯乙酸(TCA )溶液2方法称量酶液0.2 mL，加入活化剂0.25 mL放入带栓的试管中，在37水浴中保温8分钟，吸引预热1 ml 37干酪素液(质量分数1 % )放入该管中，在37水浴中反应10分钟，加入了三氯乙酸(tca )的其他取样液(活化) 将0.3 mL放入另一个带塞子的试管中，加入TCA 2 mL，在37保温10分钟后，加入预热到37的干酪素液1 mL，静置5分钟，测定2根管的A275 nm值，对云同步进行2个平行试

5、验。管理人员0 (对照)1 (样品)2 (样品)酶溶液(毫升)0.20.20.2活化剂(毫升)1.81.81.837度预热10分钟1%干酪素(毫升)01.01.037度水浴10分钟美联储2.02.02.01%干酪素(毫升)1.000摇晃，静置5分钟进行过滤奥德275纳米0.0000.1030.108(3)精制固定体系总质量为20.5 g，在由PEG (分子量6，000 )质量百分率为22.0%、(NH4)2SO4质量百分率为14.6%、pH为5.0、粗酶催化剂添加量为7.5%构成的双水相体系中在室温下静置分相后体积毫升紫外吸光率A275nm纳米上相90.32下相170.02(4)修正算法和结果R=9/17=0.529粗酶活力=(0. 103-0.0139 )/10.496/181.2 * 100000/0.03=156.16上相酶活力=(0. 32-0.0139 )/10.496/181.2 * 100000/0.02=804.7下相酶活力