第3章-蛋白质---生物化学课件.ppt

1、第三章 蛋白质 蛋白质（protein）是由许多氨基酸（amino acids）通过肽键（peptide bond）相连形成的高分子含氮化合物。 蛋白质是生活细胞内含量最丰富、功能最复杂的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过程。因此，研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本的命题。,1.蛋白质是生物体的重要组成成分 分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。 含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45%，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80%。,2.蛋白质具有重要的生物学功能 作为生物催化剂 代谢调节作用 免疫保护作用 物质的转运和存储

2、 运动与支持作用 参与细胞间信息传递 其他生物学功能：营养蛋白、结构蛋白、毒蛋白。 3.氧化供能,3.1 氨基酸、多肽和蛋白质 1.蛋白质元素组成 主要元素：C（50% 55%）、H（6% 8%）、O（19% 24%）、N（13% 19%）和S（0.3% 5%），有些蛋白质含有少量P或金属元素Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo，个别蛋白质还含有I。 特点：各种蛋白质的含氮量很接近，平均含氮量为16%。 定氮法测定蛋白质含量： 蛋白质含量6.25样品含氮量,2.结构单位氨基酸（amino acid） 蛋白质水解后可得各种氨基酸，蛋白质种类繁多，但大多数由20种基本氨基酸构成。 3.多肽 多肽是由

3、氨基酸以酰胺键形式连接而成的线性大分子。多肽可在生物体内单独存在，但大多是作为蛋白质的组成部分。,3.2 氨基酸（amino acid） 存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成天然蛋白质的氨基酸（编码氨基酸）仅有20种，且均属 L氨基酸。 氨基酸：脯氨酸（亚氨基酸）除外； L氨基酸：甘氨酸（不含手性碳原子）除外。,3.2.1 氨基酸的结构和分类,20种氨基酸的结构,氨基酸的分类：按其侧链R的结构和理化性质分类 1.非极性疏水性氨基酸 2.极性中性氨基酸 3.酸性氨基酸 4.碱性氨基酸,非极性、疏水氨基酸(非极性R基氨基酸)： Val, Leu, Ile（支链）；Gly（无旋光异构）；Met（

4、含硫）；Phe（芳香族）；Pro（亚氨基） 极性、中性氨基酸(不带电荷的极性R基氨基酸) ： Ser, Thr（含羟基）；Tyr, Trp（芳香族）；Cys（含硫）；Gln, Asn（含酰氨）,酸性氨基酸（含有两个羧基）： Glu（含羧基）、Asp（含羧基） 碱性氨基酸（含有两个以上氨基）： Arg（胍基）、His（咪唑基）、Lys（氨基）,据R基团化学结构分类,脂肪族AA（中性、含羟基或巯基、酸性、碱性）,芳香族AA(Phe、Tyr、Trp),杂环AA(His、Pro),据R基团极性分类,极性R基团AA,非极性R基团AA（种）,不带电荷（种）,带电荷：正电荷（种）负电荷（种）,据氨基、羧基数

5、分类,一氨基一羧基AA,一氨基二羧基AA(Glu、Asp),二氨基一羧基AA(Lys、His、Arg),人的必需氨基酸 LysTrpPheValMetLeuIleThr Arg、His,二十种常见蛋白质氨基酸的习惯分类,几种特殊氨基酸 Gly：无手性碳原子。 Pro：为环状亚氨基酸。 Cys：可形成二硫键。,修饰氨基酸： 蛋白质合成后通过修饰加工生成的氨基酸，没有相应的遗传编码。这些稀有氨基酸仅存在于少数蛋白质的组成中，它们都是相应常见氨基酸的衍生物。如：胶原蛋白中的4-羟脯氨酸（Hyp）和5-羟赖氨酸（Hyl）；肌球蛋白中的6-N-甲基赖氨酸；甲状腺球蛋白中的3,5-二碘酪氨酸胱氨酸。,非蛋

6、白氨基酸： 在自然界中存在、但不是构成蛋白质的成分，这样的氨基酸称为非蛋白质氨基酸。现已发现150多种非蛋白质氨基酸。非蛋白质氨基酸以游离状态或结合状态存在，大多数是蛋白质中存在的L型-氨基酸的衍生物，但是也有一些是-氨基酸、-氨基酸或-氨基酸，还有一些是D型氨基酸。非蛋白质氨基酸中有些是重要的代谢物前体或代谢中间产物，有些是体内重要的生物活性物质。,如：-丙氨酸是维生素B3（泛酸）的组成成分；L-鸟氨酸、L-瓜氨酸是尿素循环的中间产物；-氨基丁酸是传递神经冲动的化学介质（又称神经递质）；D-环丝氨酸是一种由链霉菌产生的抗生素，能抑制细菌细胞壁的形成。,3.2.2 氨基酸的理化性质 1.物理性

7、质 都是白色结晶。 熔点高，约在230以上，大多没有确切的熔点；200以上易分解，因此熔点熔融时会分解并放出CO2。 易溶于水等极性溶剂中，而难溶于烃、醚等非极性化合物中。都能溶于强酸和强碱溶液中，除胱氨酸、酪氨酸、二碘甲状腺素外，均溶于水；除脯氨酸和羟脯氨酸外，均难溶于乙醇和乙醚。,2.两性解离,等电点（isoelectric point, pI）：在某一pH环境中，氨基酸解离成阳性离子及阴性离子的趋势相等，所带净电荷为零，在电场中不泳动。此时，氨基酸所处环境的pH值称为该种氨基酸的等电点(pI)。 带电状态判定 pIpH0 带负电 pIpH0 带正电 pIpH0 不带电,等电点计算 侧链为

8、非极性基团或虽为极性基团但不解离的氨基酸：pI(pK1+pK2)/2 酸性氨基酸(Glu、Asp)及Cys： pI(pK1+pKRCOO-)/2 碱性氨基酸(赖、精、组)： pI(pK2+pKRNH2)/2,3.紫外吸收： Trp、Tyr和Phe的侧链都存在共轭双键，因此在280nm波长附近具有最大吸收峰，其中Trp的最大吸收最接近280nm。,4.旋光性 不对称碳原子 旋光性物质：右旋性（）、左旋性（） 光学异构体：有一个不对称碳原子就有2个光学异构体，有两个不对称碳原子就有4个光学异构体。,5.氨基酸的化学性质 -NH2参加的反应 与甲醛发生羟甲基化反应 生成二羟甲基衍生物，用酸碱滴定（酚

9、酞指示剂）测定氨基酸浓度。 与亚硝酸反应 范斯来克（Van Slyke）法测定氨基酸，标准条件下测定生成的氮气体积，即可计算出氨基酸的量。生成的氮气一半来自氨基酸。,酰化反应 苄氧甲酰氯（carbobenzyloxychloride,Cbz-cl) 叔丁氧甲酰氯 对-甲苯磺酰氯 邻苯二甲酸酐 酰卤或酸酐在弱碱条件下可与氨基酸发生酰化反应，生成酰胺。在多肽与蛋白质的人工合成中被用作氨基保护剂，及用于多肽链N-端氨基测定。,丹磺酰氯（DNS-cl，5二甲基氨基萘-1-磺酰氯）常用于多肽链NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。,烷基化反应 -氨基中的氮是一个亲核中心，能发生亲核取代反应。 氨

10、基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)反应生成DNP-氨基酸，黄色，层析法鉴定，被Sanger用来测定多肽的NH2末端氨基酸。 Sanger(桑格) ：英国化学家，在生物化学领域的贡献很大，他两次获诺贝尔奖1958和1980年；1953年确定了牛胰岛素一级结构；1975年和1977年确定了DNA的两种用酶测序的方法加减法和终止法。,氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应）,DNFB（dinitrofiuorobenzene）,DNP-AA(黄色),+,+ HF,氨基酸,Edman反应：苯异硫氰酸酯（PITC）与氨基酸生成苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸），无色，可以用层

11、析法分离鉴定。被Edman用来鉴定多肽的NH2末端氨基酸。 这种技术每次都只是从蛋白质的N端解离和鉴定一个氨基酸残基,这是一项使蛋白质序列分析革命化的技术。,氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应（Edman反应）,PITC（phenylisothiocyanate）,+,苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA）,生成西佛碱的反应（Schiff） 氨基酸的氨基与醛酮发生加成-消除反应，生成西佛碱。西佛碱是某些酶促反应的中间产物（如转氨基反应的中间产物）。 脱氨基和转氨基反应 氨基酸的氨基在氨基酸氧化酶催化下，可脱去氨基生成-酮酸，而在转氨酶催化下

12、氨基酸的-氨基可转移至-酮酸上。,-羧基参加的反应 成盐、成酯反应：羧基被保护，氨基被活化，重金属盐不溶于水。 成酰卤的反应 氨基被保护后，羧基可与二氯亚砜或五氯化磷反应，生成酰氯，使羧基活化，在多肽的人工合成中常用。 叠氮反应 活化羧基，常用于多肽的人工合成。 脱羧基反应 Glu脱羧形成-氨基丁酸。,-氨基和-羧基共同参与 显色反应 氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收波长在570nm。由于此波长吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。例外：Pro黄色；Asn棕色。,成肽反应,侧链R基参加的反应 功能团：羟基、酚基、巯基(包括二硫键)、吲哚基、咪

13、唑基、胍基、甲硫基、非- 氨基和非-羧基等。 侧链功能团发生共价化学改变 蛋白质的化学修饰,3.3 多肽 3.3.1 多肽 肽键(peptide bond)：一个氨基酸的-羧基与另一氨基酸的-氨基缩水而成的酰胺键称为肽键（CONH）。两个氨基酸残基构成一个二肽，多个氨基酸残基组成的肽就是多肽。 在书写多肽链结构时，总是从左到右，把含有-NH2基的氨基酸残基写在多肽链的左边，称为N-末端(氨基端)，把含有-COOH基的氨基酸残基写在多肽链的右边，称为C-末端(羧基端)。,多肽链,3.3.2 肽键 肽平面(peptide unit)：由肽键中的四个原子和与之相邻的两个碳原子共同构成的刚性平面。（C

14、CONHC） 肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转，存在顺反两种结构。,肽单元 参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式（trans）构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元（peptide unit）。,几个概念 肽是由氨基酸通过肽键缩合而成的化合物。 两分子的氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合形成三肽 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽（oligopeptide），由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽（polypetide）。 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，称之为氨基酸残基（residue）。,3.3.3 多肽

15、的性质 酸碱性质、重要化学反应类似于氨基酸性质。 3.3.4 生物活性肽 除了构成蛋白质，还有一些分子量较小的游离多肽，通常具有特殊的生理功能。 谷胱甘肽 神经肽：脑啡肽、内啡肽、强啡肽、P物质、Y肽 肽类激素：催产素、加压素等 其他：生长因子；短杆菌肽S；甜味肽等,1.谷胱甘肽（glutathione, GSH） 谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽 谷氨酸的-羧基形成肽键 SH为活性基团 为酸性肽 是体内重要的还原剂 谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。,GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,主要功能:,体内许

16、多激素属寡肽或多肽,促甲状腺素释放激素(TRH),短杆菌肽S（抗生素）,NH2 CH C NH CH C ,-天冬氨酰-苯丙氨酸甲酯（甜味肽）,3.4 蛋白质 氨基酸是组成蛋白质的基本单位，氨基酸通过脱水缩合形成多肽链。 每一条多肽链有二十数百个氨基酸残基不等，各种氨基酸残基按一定的顺序排列。 蛋白质由一条或多条多肽链组成的生物大分子。 产生蛋白质的细胞器是核糖体。,根据蛋白质组成成分,根据蛋白质形状,3.4.1 蛋白质的分类和性质1.蛋白质的分类,纤维状蛋白质,球状蛋白质,按照生物功能分类：酶、调节蛋白、转运蛋白、运动蛋白、防御蛋白、营养蛋白、储存蛋白、结构蛋白、毒蛋白，等。,单纯蛋白质（只

17、有氨基酸组分）,结合蛋白质蛋白质部分非蛋白质部分（辅基）,2.蛋白质的性质 蛋白质的两性电离和电泳现象 蛋白质分子中除两端的游离氨基和羧基外，侧链中还有一些解离基，因此会两性解离，可以在电场中移动。它所带的电荷，既取决于其分子组成中碱性和酸性氨基酸的含量，又受所处溶液的pH影响。当游离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子（zwitterion），此pH值称为蛋白质的等电点（isoelectric point)。 人体体液中许多蛋白质的等电点在pH5.0左右，所以在体液中以负离子形式存在。,蛋白质的胶体性质 蛋白质分子量介于一万到百万之间，其分子的大小已达到胶粒1100nm范围之内。 球状蛋白

18、质的表面多亲水基团（氨基、羧基、羟基、酰氨基等），强烈吸引水分子，使蛋白质分子表面常为多层水分子所包围，称水化膜（溶剂化层），从而阻止蛋白质颗粒的相互聚集。 非等电状态时，蛋白质具有同种表面电荷而互相排斥。 蛋白质分子在水溶液中具有胶体溶液的通性：布朗运动、丁达耳现象、不能通过半透膜。,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,蛋白质的变性 天然蛋白质在某些物理或化学因素作用下，空间结构被破坏，导致理化性质改变和生物学活性的丧失，称为蛋白质的变性（denaturation）。 变性时蛋白质溶解度降低、沉淀；紫外吸收、化学活性及粘度增加，结晶性破坏；且疏水基团外露，分子结构伸展松散，易被蛋白酶水解。 变性蛋白

19、质只有空间构象的破坏，其本质是次级键，有时包括二硫键的破坏，不涉及一级结构的变化。,引起蛋白质变性的原因可分为两类。物理因素可以是加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波的作用等；化学因素有强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)等。 变性并非是不可逆的变化，当变性程度较轻时，如去除变性因素，有的蛋白质仍能恢复或部分恢复其原来的构象及功能，变性的可逆变化称为复性（renaturation）。,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,核糖核酸酶的变性与复性,应用 利用变性： 酒精消毒 高压灭菌 无蛋白血滤液制备 防止变性：低温保存生

20、物制品 取代变性：乳品解毒(用于急救重金属中毒)。,蛋白质的沉淀（precipitation） 蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有两种稳定因素，即颗粒表面的水化层和电荷，其稳定性与相对分子大小也有关。在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀。 变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉淀，在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀。,盐析(Salting Out) 在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性（破坏水化膜、中和电荷）而使其析出，这种方法称为盐析。 常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠

21、等。,各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同，故可用于对混和蛋白质组分的分离。 例如：用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白，饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来。 盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保证蛋白质的活性。 调节蛋白质溶液的pH至等电点后，再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好。,重金属盐沉淀蛋白质 蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐沉淀，沉淀的条件以pH稍大于等电点为宜。因为此时蛋白质分子有较多的负离子易与重金属离子结合成盐。重金属沉淀的蛋白质常是变性的，但若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质。 临床上利用蛋白质能与重金属盐结合的

22、这种性质，抢救误服重金属盐中毒的病人，给病人口服大量蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。,生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质 蛋白质又可与生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)结合成不溶性的盐沉淀，沉淀的条件应当是pH小于等电点，这样蛋白质带正电荷易于与酸根负离子结合成盐。 临床血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质。,有机溶剂沉淀蛋白质 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，降低介电常数，在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性，例

23、如酒精消毒灭菌。但若在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备各种血浆蛋白质。 抗体-抗原沉淀 抗体和抗原通过互相识别和结合而发生沉淀，这是生物体免疫功能的基础。,加热凝固 将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热，可使蛋白质发生凝固（coagulation）而沉淀。 加热使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,蛋白质的变性、沉淀，凝固相互之间有很密切的关系。但蛋白质变性后并不一定沉淀，变性蛋白质只在等电点附近才沉淀，沉淀的变性蛋白质也不一定

24、凝固。,蛋白质的呈色反应 茚三酮反应（Ninhydrin Reaction） 双缩脲反应(Biuret Reaction) 蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，称双缩脲反应。凡分子中含有两个以上-CO-NH-键的化合物都呈此反应。双缩尿反应可检测蛋白质的水解程度。,米伦反应（Millon Reaction） 蛋白质溶液中加入米伦试剂（亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混和液），蛋白质首先沉淀，加热则变为红色沉淀，此为酪氨酸的酚核所特有的反应。 此外，蛋白质溶液还可与酚试剂、乙醛酸试剂、浓硝酸等发生颜色反应。,蛋白质的紫外吸收 大部分蛋白均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，因此在280nm处有

25、特征吸收，可用此性质对蛋白质进行定性、定量鉴定。 3.4.2 蛋白质的分离和纯化 纯化的实质： 增加制品（preparation）的纯度或比活性 一般程序： 前处理、粗分级、细分级、浓缩与保存,1.前处理： 将组织和细胞破碎 动物组织和细胞： 电动捣碎机（waring blender) 匀浆器（homogenizer） 超声波处理（ultrasonication) 植物组织和细胞：石英砂提取液，研磨 纤维素酶处理 细菌：超声波震荡、石英砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理（分解肽聚糖）,适当溶剂抽提，然后用差速离心法收集细胞组分（differential centrifugation) 如果提取膜蛋白

26、 超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。 组织、细胞破碎常用方法：研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等。,2.粗分级（rough fractionation) 一般用选择性沉淀法： (NH4)2SO4分级沉淀法（盐析） 等电点选择性沉淀法 有机溶剂分级沉淀法 热处理选择性沉淀法 生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法,3.细分级（fine fractionation) 纯化基本原理： 根据蛋白质的溶解度分离 根据电荷差异分离 根据分子大小分离 根据配体特性异性分离（亲和层析） 选择性吸附分离（物理吸附） 根据疏水性的差异,透析和超滤 透析除盐：利用透析袋（玻璃纸或高分子材料）把大分子蛋白质与小分子

27、化合物分开的方法。 超滤法：应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇、甲醇等其它与水亲合力强制有机溶剂。沉淀时要控制有机溶剂浓度及低温以避免蛋白质变性。 盐析（salt precipitation）是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,免疫沉淀法： 将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并

28、形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,电泳（elctrophoresis）： 蛋白质可两性解离，在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳。 影响因素：电荷种类及数量、分子大小及形状、溶液离子强度及pH等。,电泳种类：自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳等）、盘状电泳、等电聚焦、双向电泳。 几种重要的蛋白质电泳： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：常用于蛋白质分子量的测定。 等电聚焦电泳：通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 双向凝胶电泳：是

29、蛋白质组学研究的重要技术。,层析(chromatography) 基本原理： 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。 常用的层析方法: 凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相HPLC）。,离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量、分子量及分子形状等性质不同进行分离。,凝胶过滤（gel filtration）又称分子筛层析：利用各蛋白质分子大小及形状不同分离。 大分子先洗脱下来。,亲和层析：不同蛋白质有独特的生物特性，对于固

30、定在载体的特殊配基有不同的识别和结合能力，常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋白等。 吸附层析：吸附特性,超速离心法（ultracentrifugation） 根据蛋白质分子大小及形状、溶液特性进行分离。既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 蛋白质在离心场中的行为用沉降系数（sedimentation coefficient，S）表示，沉降系数大体上与分子量成正比，S与蛋白质的密度和形状相关，对于分子形状高度不对称的大多数纤维状蛋白不适用。 最常用的是差速离心和密度梯度离心。,差速离心：是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。此法适用于

31、混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。 密度梯度离心：在分离沉降系数接近的物质时广泛使用。这种方法使用一种密度能形成梯度（在离心管中，其密度从上到下连续增高）又不会使所分离的生物活性物质凝聚或失活的溶剂系统，离心后各物质颗粒能按其各自的比重平衡在相应的溶剂密度中形成区带。常用的密度梯度溶剂是蔗糖或氯化铯（CsCl）溶液。,4.浓缩与保存 浓缩方法：透析袋、超滤、小孔径凝胶、浓缩胶等。 保存方法： 晶体保存：结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度 的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。 结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机

32、溶剂、调节pH、接入晶种。 冻干粉保存： 溶液保存：加入抗冻剂（50%甘油）后2070保存。,3.5 蛋白质的结构 蛋白质由一条或多条多肽链按特定的空间构型组成的生物大分子。 蛋白质的分子结构包括： 一级结构（primary structure） 二级结构（secondary structure） 三级结构（tertiary structure） 四级结构（quaternary structure）,高级结构,3.5.1 蛋白质的一级结构(primary structure) 一级结构是指蛋白质的多肽链中氨基酸的排列顺序；主要靠肽键维系。 二四级结构称为蛋白质的空间结构，或空间构象；主要靠次级

33、键维系，尤其是疏水键。 一级结构体现生物信息：20n 多样 一级结构是空间结构及生物活性的基础 特异 一级结构的连接键：肽键（主要）、二硫键,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。,胰岛素的一级结构,多肽链中氨基酸序列分析 改进的Sanger法 1.分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 2.测定多肽链的N端与C端的氨基酸残基 3.把肽链水解成片段，分别进行分析 4.测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法 5.经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。,水解肽链的方法及特征,通过核酸推演的方法,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码蛋白质的基因,测定DNA

34、序列,排列出mRNA序列,3.5.2 蛋白质的三维结构 1.二级结构 蛋白质的二级结构是指多肽链骨架中原子的局部空间排列，不涉及侧链的构象，也就是该肽段主链骨架原子的相对空间位置，主要有-螺旋、-折叠、-转角和无规则卷曲。 维持二级结构的力量为氢键。,-螺旋（-helix） 右手螺旋：3.6个AA/圈，螺距0.54nm； 氢键维系：链内氢键（AA1AA4），平行长轴； 侧链伸出螺旋。,-折叠(-pleated sheet) 多肽链充分伸展，相邻肽单元之间折叠成锯齿状结构，侧链交错位于锯齿结构的上下方。 两段以上的-折叠结构平行排列，两链间可顺向平行，也可反向平行。 两链间的肽键之间形成氢键，以

35、稳固-折叠结构。氢键与螺旋长轴垂直。,其它 肽链主链出现的180回折部分称-转角。 蛋白质分子中那些没有确定规律性的部分肽链构象称为无规卷曲。,多肽链中氨基酸残基n的羰基上的氧与残基(n+3)的氮原上的氢之间形成氢键，肽键回折180。,细胞色素C的三级结构,无规则卷曲示意图,无规则卷曲常见于球状蛋白质分子中，在其它类型二级结构肽段之间起活节作用，有利于整条肽链盘曲折叠。,影响二级结构形成的因素 蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或-折叠，它就会出现相应的二级结构。,次级键介导蛋白质高级结构形成,超二级结构、域结构 超二级结构（supersecondar

36、y structure） 基序或模序（motifs or modules，模体符） 在许多蛋白质中，有两个或三个具有二级结构的肽段在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，称为模序。有的将这种规则的二级结构的聚集体称为超二级结构，它们可直接作为三级结构的“建筑块”或域结构的组成单位，是蛋白质发挥特定功能的基础。 类型：、锌指结构、亮氨酸拉链,钙结合蛋白中结合钙离子的模体,锌指结构,域结构（domain，结构域） 域结构是在较大的蛋白质分子中所形成的两个或多个在空间上可明显区别的局部区域。结构域具有独特的空间构象，与分子整体以共价键相连，并承担特定的生物学功能。 结构域与分子整体以共价键相连； 具有相对独立的空间构象和生物学功能； 同一蛋白质中的结构域可以相同或不同，不同蛋白质中的结构域也可能相同或不同。,-螺旋,-转角,-折叠,二硫键,结构域1,结构域2,卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域,2.三级结构 蛋白质的三级结构是指在一条多肽链中所有原子