第十三章多肽与蛋白质类药物

1、第十三章、多肽与蛋白质类药物,主要内容： 多肽与蛋白质类药物的生产方法 多肽类药物 蛋白质类药物,第一节、多肽及蛋白质类药物的生产方法,一、蛋白质类药物的分离与纯化： （一）材料选择： 来源有动植物组织、微生物等，原则上是选择富含目的蛋白质或多肽成分的、易于获得和易于提取的无公害生物材料。 对于天然蛋白质类药物，为提高质量、产量和降低成本，对原料的种属、发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞都有一定的要求。比如： （1）种属：如牛胰含胰岛素单位比猪胰高，而牛胰岛素的抗原性比猪胰岛素抗原性高。 （2）发育阶段：如幼年动物胸腺比较发达，老龄后逐渐萎缩，因此胸腺原料必须采自幼

2、龄动物。HCG在妊娠妇女60-70天的尿中达到高峰，等等。 （3）生物状态：如饱食后胰岛素含量高；严重再生障碍性贫血患者尿中的EPO含量高，等等。,（4）原料来源：如血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪颚下腺中提取，两者生物学功能并饿二致，而稳定性以颚下腺来源为好。 （5）原料解剖学部位：如猪胰脏中，胰尾部位含激素较多。而胃膜素以采取全胃黏膜为好；胃蛋白酶则以采取胃底部黏膜为好。 （6）对生物技术产品宿主菌或细胞的要求：主要是考虑表达量、后处理的难易等。,（二）蛋白质提纯的一般方法： 1、根据等电点的不同来纯化蛋白质 有 等电点沉淀法、等电点沉淀和盐析法联用法、等电点聚焦法等 2、根据蛋白质分子形状和

3、大小的不同来纯化蛋白质 有 凝胶过滤法、超滤法、离心法、透析法等 3、根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋白质 有蛋白质的盐溶与盐析法、结晶法、低温下有机溶剂沉淀法 4、根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质 主要是离子交换层析法，有不同的离子交换剂和不同的交换层惜条件 5、根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质 主要手段是亲和层惜法,6、根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来纯化蛋白质 可用疏水柱或反向HPLC来纯化 7、根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质 主要是逆流分溶法（原理类似于萃取） 8、根据蛋白质受物理、化学等作用因素的影响来纯化蛋白质 利用不同蛋白质变性条件不同来分离不同的蛋

4、白质 9、根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质 一些特殊的吸附层析法，如羟灰石、硅藻土、氧化铝、活性炭等吸附 10、根据酶对蛋白质的作用来纯化蛋白质 如SOD能抗蛋白酶的水解，可用蛋白水解酶降解其它蛋白质，以便于SOD的进一步纯化,（三）蛋白质的分离和纯化 1、时间因素：纯化处理的时间要控制好 2、选择离子交换层析条件的程序： 如离子交换剂的选择及其使用条件的选择 3、蛋白质分离纯化的可能的技术手段的组合：（略）,（四）溶液中蛋白质浓度的测定 凯氏定氮法 化学反应法 双缩脲法 福林-酚反应法 氨基黑测定法 染色法 考马斯亮蓝测定法 氯胺T测定法 灵敏度较高的方法 紫外吸收法 放射性同位素测定

5、法,1、紫外吸收法 （1）280nm光吸收法 取3ml蛋白质溶液，以缓冲液作为对照，用光径为1cm的石英比色皿，在280nm处测定吸收值；以浓度1mg/ml的蛋白质溶液的A280为1.0进行估算；也可根据文献查得相关蛋白质的标准值，再计算。 （2）280nm和260nm的吸收差法 当蛋白质溶液中含有核酸时，可用此方法进行测定。分别测得A280和A260值，再按下列公式计算： 蛋白质浓度（mg/ml）= 1.45A280 0.74260 （3）215nm和225nm的吸收差法 对于稀溶液中蛋白质浓度的测定可用此法。测得溶液的A215和A225值，再用下列经验公式进行计算： 蛋白质浓度（mg/ml

6、）= 0.144（A215 A225）,2、双缩脲法 （1）常用双缩脲法 蛋白质分子可与铜离子反应形成紫红色化合物，在540nm处比色测定，可测定蛋白质浓度。本法测定范围为1-10mg/ml。 （2）微量双缩脲法 利用蛋白质与铜离子形成的化合物在310 nm-330nm处的吸收比540nm处的吸收大得多，因此，在蛋白质浓度低时可用测定A310或A330值的方法测定蛋白质浓度。此法比540nm法灵敏10倍以上。,3、福林-酚试剂法 本方法是双缩脲法的发展。首先在碱性溶液中形成铜与蛋白质复合物，然后该复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），产生兰色；再用比色法测定A75

7、0；测定范围在0.03-0.3mg/ml；或在550nm处比色测定，测定范围为0.05-0.5mg/ml。,4、考马氏亮蓝G-250染色法（也有R-250） G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用结合后，变为兰色，可在595nm比色测定。本法反应快、操作简便、消耗样品量少；但不同蛋白质之间差异较大，且标准曲线线性较差。测定范围为0.01-1.0mg/ml。 高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵、去垢剂对测定有影响。G-250染色能力很强，比色皿一定要洗干净，而且千万记住不能用石英比色皿。 （1）溶液配制 标准蛋白质溶液配制、染色液配制。(p298) （2

8、）测定方法 作标准曲线、测定未知样品、比较、校准。,（五）纯度检查 常用蛋白质纯度检查方法有： 1、HPLC或FPLC法 常用的有效方法 2、电泳法 变性电泳和非变性电泳 3、免疫化学法 有免疫扩散、免疫电泳、双向免疫电泳扩散、放射免疫分析、酶标免疫分析等，依据是抗体抗原反应。 4、生物测定法 生物效价测定和生物学功能测定 5、分光光度法 紫外分光光度法、红外分光光度法,二、多肽与蛋白质的化学合成,有固相合成法和液相合成法两种； 多肽合成的基本步骤有： 氨基保护和羧基活化； 羧基保护和氨基活化； 接肽和除去保护基团。,1、保护基团： 主要是保护一些活性基团，如-NH2、-COOH、-SH等。

9、氨基保护基是苄氧羰酰氯（Cb2-Cl），与氨基酸或肽上氨基作用形成苄氧羰酰氨基酸（ Cb2-氨基酸）或Cb2-肽；可用氢化法或钠氨法还原除去保护基团。也可用叔丁氧羰酰氯（BOC-Cl）作保护基。 羧基保护基常用无水乙醇或甲醇在盐酸存在下进行酯化；保护基可在皂化反应是除去。 精氨酸的胍基用对甲机基磺酰基（Tos-）保护。 其它活性基团可用苄基（-B）保护，用钠氨法还原除去保护基团。,2、肽的液相合成法： 合成多肽的顺序是从C-端到N-端；因为常用羧基活化的方法，而不用氨基活化的方法（氨基活化易发生消旋化）。 肽合成法可分为阶梯伸长法和片段缩合法。 （1）阶梯伸长法： 常用的羧基活化方法是混合酸酐

10、法和活化酯法。 NCC法（N，N-二环己基碳二亚胺），首先使N-端保护的氨基酸同DCC反应，形成酸酐后，加入另一氨基酸，缩合成肽。 另一常用方法是活化酯法，带有N保护基的氨基酸对硝基芳香族酯，能与另一氨基酸酯的氨基缩合成肽。,（2）片段缩合法： 由小肽合成大肽时常用叠氮法，而且应该尽量利用Gly和Pro这两个氨基酸的C-末端接肽，这样不易消旋化。,3、肽的固相合成法： 肽链的延长是在不溶性的聚苯乙烯树脂载体沙锅内完成的。合成多肽的C-末端先和氯甲基聚苯乙烯树脂反应形成苄酯，然后按照肽链一级结构的顺序将氨基端已被保护的氨基酸逐个加上去，使肽链延长。 固相合成法比液相法操作简便、时间缩短、可以自动

11、化。 4、游离肽的获得： 合成多肽后，进行分离纯化，即可得到纯的多肽了。,固相法合成多肽示意图,第二节、多肽类药物,一、主要多肽类药物：,1、多肽激素： （1）垂体多肽类激素 如促皮质激素（ACTH）、促黑激素（MSH）、脂肪水解激素（LPH）、催产素（OT）、加压素（AVP）。 （2）下丘脑激素 如促甲状腺激素释放激素（TRH）、生长素抑制激素（GRIF）、促性腺激素释放激素（LHRH）。 （3）甲状腺激素 如甲状旁腺激素（PTH）、降钙素（CT）。 （4）胰岛激素 如胰高血糖素、胰解痉多肽。 （5）胃肠道激素 如胃必素、胆囊收缩素-促胰激素、肠必素等 （6）胸腺激素 如胸腺素、胸腺肽、胸腺

12、血清因子。,2、多肽类细胞生长调节因子： 表皮生长因子（EGF）、转移因子（TF）、心钠素（ANP） 3、含有多肽成分的其他生化药物： 骨宁、眼生素、血活素、氨肽素、蜂毒素、蛇毒素、神经营养素、胎盘提取物、花粉提取物、脾水解物、肝水解物、心脏激素、脑安肽、助应素、妇血宁等。,二、主要多肽类药物的制备：,1、胸腺激素： （1）胸腺素（Thymocin） 目前已经药用的是胸腺素组分5，由40-50种多肽组成的混合物，分子量在1KDa-15KDa之间。依据它们的等电点分为三个区域：区包括等电点低于5的组分，区包括等电点在5-7之间的组分，区包括等电点在7以上的组分。 （2）工艺路线：,工艺过程： 提

13、取 低温下匀浆、离心，得上清； 加热去杂蛋白 加热上清至80、15min，离心、得上清； 沉淀 冷至4、加-10丙酮沉淀，过滤得沉淀，干燥得丙酮粉； 分段盐析 丙酮粉溶于pH7.0 PBS，加硫铵至饱和度0.25，沉淀、离心，得上清；调pH4.0，再加硫铵至饱和度0.50，得盐析物； 超滤 盐析物溶于pH8.0的10mM Tris-Cl，超滤，取分子量在15KDa以下的超滤液； 脱盐、干燥 超滤液经Sephadex G-25脱盐后、冷冻干燥，得胸腺素。,（3）检验方法： 活力测定：E-玫瑰花结升高百分数不得低于10%； 分子量：必须低于15KDa。 （4）作用与用途： （自己看看，p305）

14、2、胸腺肽： （1）结构与性质：胸腺肽中主要是分子量为9600和7000左右的两类蛋白质或肽类，氨基酸组成达15种，必需氨基酸含量高，还含有少量核酸。对热较稳定（80时活性不降低），蛋白酶水解会使之失活。,（2）生产工艺：,工艺过程： 原料处理 取-20冷藏小牛胸腺，低温下绞碎； 制匀浆、提取 低温下加冷重蒸馏水（1:1），匀浆，浸渍提取； 部分热变性、离心、过滤 匀浆液加热至80、5min，冷至-20、2-3天；融化后4离心、微孔滤膜压滤，得澄清滤液； 超滤、提纯 将上述滤液用分子量截流值为1万以下的超滤膜进行超滤，收取分子量在1万以下的活性多肽，-20冷藏。 分装、冻干 经检验合格后，加入

15、3%甘露醇作赋形剂，用微孔滤膜除菌过滤，分装，冻干即得注射用胸腺肽。 （3）检验方法： 活力测定同胸腺素；分子量10000以下。 （4）作用与用途：（自己看看，p306）,2、促皮质素（ACTH） （1）结构与性质：是从垂体前叶提取的一种多肽激素；分子量：人为4567，猪为4593；易溶于水，等电点6.6。100加热活性不变。由39个氨基酸组成，种族差异仅仅在第25-33位上，1-24位的片段具有全部活性。可被胃蛋白酶部分水解，但仍有活力。在水溶液中存在着高度-螺旋。 （2）生产工艺：,工艺过程： 提取 垂体前叶干粉加0.5M醋酸20倍，用硫酸调节pH2.0-2.4，70-75保温10min，

16、过滤。 一次吸附 提取液调pH3.1，加投料量20%的CMC，3搅拌吸附12h，过滤。CMC用0.15M盐酸解吸，解吸液用717阴离子交换树脂处理，pH3.0以上，过滤，调pH3.1，冷藏。 二次吸附 在洗脱滤液中再加CMC，1-5搅拌吸附12h，过滤，CMC用0.1M醋酸、蒸馏水、0.01M醋酸铵（pH4.6）及0.1M醋酸铵（pH6.7）分别洗涤，最后用0.15M盐酸解吸。解吸液分别用717阴离子交换树脂及732阳离子交换树脂处理，pH调到3.0左右，冷冻干燥得ACTH。 （3）检验方法：粗品用小白鼠胸腺萎缩法测定；精品用去垂体大白鼠的肾上腺维生素C降低法测定。 （4）作用与用途：（自己看

17、看）,3、降钙素（Calcitonin,CT） （1）结构与性质：是一种调节血钙浓度的多肽激素，由甲状腺内的滤泡旁细胞（C细胞）分泌。由32个氨基酸残基组成，N-端为半胱氨酸，与7位上的半胱氨酸形成二硫键，C-端为脯氨酸。如果去掉脯氨酸，活性尽失。分子量3.5KDa，溶于水和碱性溶液，不溶于丙酮、乙醇、氯仿等。活力可被胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、多酚氧化酶、H2O2氧化、光氧化及N-溴代琥珀酰亚胺所破坏。 降钙素广泛存在于多种动物体内。在人及哺乳动物体内，主要存在于甲状腺、甲状旁腺、胸腺和肾上腺等组织中。,（2）生产工艺：,（3）工艺过程（略） （4）检验方法： 生物活性测定法：注射大白

18、鼠，1h后收集血清，测定血清钙值（对照标准品测定）。 （5）作用与用途：（自己看看）,第三节、蛋白质类药物,一、主要蛋白质类药物 1、蛋白质激素 （1）垂体蛋白质激素 生长素、催乳激素、促甲状腺素、促黄体生成素、促卵泡激素等 （2）促性腺激素 人绒毛膜促性腺激素（HCG）、绝经尿促性腺激素（HMG）、血清性促性腺激素（SGH） （3）胰岛素及其他蛋白质激素 胰岛素、胰抗脂肝素、松弛素、尿抑胃素 2、血浆蛋白 如白蛋白、纤维蛋白原、凝血因子等 3、蛋白质类细胞生长调节因子 如干扰素、IL、NGF、HGF、EPO等,4、粘蛋白 如 胃膜素、硫酸糖肽等 5、胶原蛋白 如 明胶、阿胶等 6、碱性蛋白质

19、 如 硫酸鱼精蛋白 7、蛋白酶抑制剂 如 胰蛋白酶抑制剂、大豆胰蛋白酶抑制剂等 8、植物凝集素 如 PHA、ConA等,二、主要蛋白质类药物的制备,（一）白蛋白 1、结构与性质 白蛋白为单链多肽，由575aa组成，65KDa，pI4.7，可溶于水和半饱和硫酸铵溶液；对酸较稳定；加入NaCl可提高其热稳定性。 从人血浆中分离的白蛋白有两种制品：一是从健康人血浆中分离制备的，称为血清白蛋白；另一是从孕妇胎盘血中制备的，称胎盘血白蛋白。 血浆白蛋白制剂是淡黄色略粘稠的澄清液体或白色疏松状（冻干）固体。,2、生产工艺 （1）工艺路线,（2）工艺过程 络合（利凡诺沉淀） 人血浆在搅拌下用碳酸钠溶液 调p

20、H8.6，再加入等体积2%利凡诺溶液，充分搅拌后静置2-4h，分离上清和沉淀（上清可供生产人丙种球蛋白）。,解离 沉淀溶于蒸馏水，用0.5M HCl调pH到弱酸性，加0.15%-0.2%的NaCl，不断搅拌解离。 加温 充分解离后，加热到65恒温1h，立即冷却。 分离 冷却液离心，离心液再压滤，得澄清液。 超滤 澄清液用超滤器浓缩。 热处理 浓缩液在60恒温处理10h。 澄清和除菌 压滤澄清，再用冷灭菌系统灭菌。 分装 检查合格后分装。 3、检验方法：颜色、溶解时间、水分、pH、白蛋白含量、残余硫酸铵含量、无菌试验、安全性试验等。 4、作用与用途（略）,（二）干扰素 1、结构与性质 是一类细胞

21、因子，有提高免疫力功能，分为、三型，同一型别，根据氨基酸的序列差异，又可分为若干亚型；三种型别的干扰素的理化和生物学性质有差异，具体见p311表13-8。 2、生产工艺 （1）工艺路线 （有从血浆白细胞中分离的方法和基因工程的方法）,（2）工艺过程 分离灰黄层 取健康人血液，离心分离，吸取灰黄色层，置4冰箱。 氯化铵处理 灰黄色层为白细胞层，用0.83%氯化铵处理，以除去残存的红细胞。用培养液培养，记数并细胞密度调为107个/ml。 启动诱生 加入白细胞干扰素，终浓度为100u/ml，置37水浴培养2h。 正式诱生 加入仙台病毒，终浓度为100-150血凝单位/ml，在37搅拌培养过夜。 收获

22、 次日晨将培养物离心，上清液即是粗制干扰素。 纯化 粗制品中加入KSCN至0.5M，用HCl调pH3.5；离心，弃上清；沉淀加冷乙醇，离心、弃沉淀；上清用HCl调pH5.8，离心，上清和沉淀分别处理均可得干扰素纯品。,3、检验方法 效价测定法（见p313） 4、作用与用途（p313，自己看看）,（三）胰岛素 1、结构与性质 由51aa组成，有A、B两条链；A链含21个氨基酸，B链含30个氨基酸；两条链之间由两个二硫健相连，在A链内还有一条二硫健；胰岛素的同源性很高。胰岛素原是一条链，加工去掉一段C肽，形成三个二硫健后，即成为有活性的胰岛素。 胰岛素的性质有： 白色结晶粉末；分子量约为5.7KDa，pI为5.30-5.35； 在pH4.5-6.5几乎不溶于水，易溶于稀酸、稀碱； 在弱酸性溶液中稳定；在水溶液中能产生聚合和解聚现象； 具有蛋白质的一切化学性质；等等。,2、生产工艺：主要有酸醇法和锌沉淀法；下面介绍酸醇法 （1）工艺路线,（2）工艺过程 提取 冻胰块刨碎，用一定浓度的乙醇和草酸提取两次，提取液合并。 碱化、酸化 提取液用氨水调pH8.0-