玛丽安万年青茎段培养中内源菌污染防止研究

1、玛丽安万年青茎段培养中内源菌污染的防止研究,一、目前主要进行组织培养研究的观叶草本植物 1 天南星科 粗勒草属 红叶粗勒草 2 天南星科 绿萝属 金叶葛、阳光葛、白金葛,红叶粗肋草可大致分为4类： 1）红脉类：叶脉或近叶脉叶肉呈现红色，如红峡、红龙、邦德、龙焰（烟花）； 2）全红叶类：叶片全部或大部分呈现红色，如日出； 3）花叶类：叶片上呈现不规则的红色斑块或条纹，如日出、如意、贵夫人； 4）镶边类：叶片边缘为红色，如口红、极光。,红叶粗肋草系列贵夫人（吉祥）,红叶粗肋草系列如意（火红万年青）,红叶粗肋草系列日出（狐仙、激情）,红叶粗肋草系列灿烂（烟花）,红叶粗肋草系列邦德,红叶粗肋草系列红峡

2、,红叶粗肋草系列午夜女郎（中国红）,红叶粗肋草系列孔雀开屏,红叶粗肋草系列极光（万年红）,红叶粗肋草系列甜梦,红叶粗肋草系列红龙（中国龙）,其他保存品种（耐寒性能差）,柠檬美,口红,龙焰,绿萝类,阳光葛,金叶葛,二、玛丽安万年青茎段培养中污染的防止,玛丽安万年青又名粉黛(Dieffenbachia Camilla)，为天南星科花叶万年青属(又名黛粉叶属)植物。原产南美巴西，喜温暖、湿润和半阴环境，它为多年生常绿草本。茎多肉质，叶卵状椭圆形、宽大，绿色叶片嵌入黄、白色斑，优美高雅，1996年从国外引进，是室内装饰的重要观叶植物。,黛粉叶叶片大，具有美丽的色斑，适合盆栽观赏，点缀客厅、书房，清新大

3、方，十分舒泰、幽雅。 用它摆放光度较低的公共场所，黛粉叶仍然生长正常，碧叶青青，枝繁叶茂，充满生机，特别适合在现代建筑中配置。,在植物的组织培养过程中，存在两种类型的污染，一是通常讲的污染，即因外植体消毒不彻底、无菌操作和培养过程中如培养基、接种工具、接种室消毒不严格或操作不规范而导致的污染，见图1-4。 还有一类是内源菌污染。那些生长在高温多雨的热带、亚热带植物和多年生木本植物容易表现内源细菌污染。内源细菌不能被一般的表面消毒方法所消除，若未能对其有效的消除，它将随着材料进入培养过程，引起不同程度的污染，产生程度不一的危害。在早期往往会导致培养失败，增殖率降低，培养物生长减缓，玻璃化苗增加等

4、;后期则导致试管苗移栽困难和死亡。有时污染还会引起培养物的遗传变异。,赛雷氏杆菌,图1,水迹状,图2,粘液状,图3,发泡状,图4,天南星科黛粉叶属的玛丽安万年青在茎段培养中特别容易污染，我们以其作为试材，通过预培养、减压灭菌和在培养基加入不同种类的抗生素、不同浓度及不同浓度的组合处理，进行筛选研究，以期找到防止外植体内源细菌污染的有效方法。,1 材料和方法,1.1 材料 天南星科（Araceae）黛粉叶属玛丽安万年青（Dieffenbachia amoena Camilla.），取自于仲恺农业工程学院教学科研基地。 1.2 方法 用手术刀将玛丽安万年青的叶片剥去，露出腋芽，用自来水冲洗干净后用

5、肥皂水冲洗1次，再用自来水浸泡2-3h后冲洗干净，凉干。 1.3 培养基的制备 以MS培养基为基本培养基，不加任何植物生长调节剂，蔗糖2%，琼脂6%，pH5.8。 1.4 消毒灭菌 1.4.1外植体常规消毒 用75%的酒精浸泡1min，无菌水冲洗1-2次，再用0.1% HgCl2浸泡15min，无菌水冲洗3-5次。,1.4.2 外植体的预培养 将洗干净的外植体分别置于5种浓度均为500 mg.L-1的抗菌素溶液中并在摇床上振荡1 d，取出用自来水冲洗干净，其他方法步骤同1.4.1。 1.4.3 抗菌素预培养浓度的筛选 选出预处理中表现最好的一种抗菌素，分别于培养基中加入不同浓度的抗菌素对外植体

6、进行1 d的预培养，其他方法步骤同1.4.1。,1.4.4 减压灭菌 常规减压灭菌：用 0.1% HgCl2减压抽滤（真空压力为018 kg.cm-2，下同）8 min，以无菌水冲洗12次，再用0.1% HgCl2浸泡5 min，无菌水冲洗35次后接种。 加入抗菌素的减压灭菌：配制浓度均为500 mg.L-1的5种抗菌素（其中ANB1、ANB2分别由江西东方制药厂和上海嘉善善生药业有限公司出品，其他为市售），分别与0.1% HgCl2的混合，将外植体置于溶液中进行减压8 min，无菌水冲洗12次，再用0.1% HgCl2浸泡5 min，无菌水冲洗35次后接种。,1.4.5 抗生素减压过滤灭菌

7、由于抗生素在高温高压下易分解，应采取减压过滤灭菌。将配制浓度为50mg.L-1的氨苄青霉素（ampicillin）、氯霉素（chloramphenicol）、利福平（rifampin）、庆大霉素（gentamycin）、链霉素（streptomycin）、先锋霉素6号（cefradine）和卡拉霉素（kanamycin）7种抗生素在超净工作台用已灭菌的注射器和一次性滤器进行过滤灭菌，然后加入尚未凝固的培养基中。一次性滤器采用Gelman Laboratory 生产的孔径为0.2m滤器。 1.4.6 抗生素浓度的筛选 选出第一阶段培养中表现最好的两种抗生素利福平和氯霉素，设定不同的浓度0 mg.

8、L-1、50mg.L-1、100mg.L-1、150mg.L-1，进行最佳浓度的筛选。,1.4.7 不同利福平和氯霉素浓度组合的筛选 以50mg.L-1利福平作对照，设计25mg.L-1利福平+25mg.L-1氯霉素、25mg.L-1利福平+50mg.L-1氯霉素、50mg.L-1利福平+25mg.L-1氯霉素和50mg.L-1利福平+50mg.L-1氯霉素4种组合，进行最佳浓度组合筛选。 1.5 培养条件与统计 培养室温度25-28，光照2000-4000lx，每天光照12-14h，20d后观察统计。数据采用SPSS10.0软件分析处理。,过滤灭菌,2 结果与分析,2.1 玛丽安万年青茎段培

9、养中内源菌污染症状 经过严格的常规消毒，玛丽安万年青茎段初代培养中仍然存在严重的污染。有些污染并不形成明显的菌落，而只在培养基内部形成“丝状物”或“晕状物”，不容易被肉眼察觉，如不仔细观察很容易被忽视，只在背光检查时才易被发现，随着培养天数的增加，菌量逐渐累积，才在培养基上显现出来，见图6。,A,B,图6 玛丽安万年青茎段培养中内源菌污染症状（A丝状，B晕圈状）,2.2 外植体的预处理对玛丽安万年青茎段培养污染防止的效果 采用ANB1和ANB2处理材料所取得的效果较好，未污染率和成活率都比较高，都达到50%以上。其中ANB2的未污染率达到76.7%、成活率为50.0%（表1），说明ANB2这种

10、抗生素能比较有效地抑制外植体内源细菌的污染。,表1 不同抗生素预处理对玛丽安万年青茎段培养污染防止的影响,2.3 减压抽滤对玛丽安万年青茎段培养污染防止的效果 采用0.1% HgCl2浸泡，减压灭菌8 min，再用0.1% HgCl2消毒材料，未污染率为60.0%，成活率为43.3%，效果优于常规消毒（表2）。,表2 常规消毒与减压抽滤对玛丽安万年青茎段污染防止效果的比较,2.4加入抗生素后减压灭菌对玛丽安万年青茎段培养污染防止的效果 加入不同抗生素后进行真空减压灭菌，对污染防止的效果低于对照，实验中还观察到有的组合起化学反应，从而影响了抑菌的效果（表3）。,表3 0.1% HgCl2分别与不

11、同抗生素进行真空减压灭菌对玛丽安万年青茎段培养污染防止的效果,2.5 ANB2抗菌素预处理浓度对玛丽安万年青茎段培养污染防止的效果 以300、400、500 mg.L-1的ANB2预处理，3种浓度的抑菌效果相比差异不明显（表4）。但从使用成本角度出发，300 mg.L-1的ANB2比较经济。,表4 不同ANB2预处理浓度对玛丽安万年青茎段培养污染防止的效果,2.6不同抗生素种类对玛丽安万年青茎段培养污染防止的影响 结果表明（见表5），氯霉素和利福平处理材料后的未污染率和成活率都比较高，与CK、庆大霉素、卡拉霉素、链霉素、青霉素、先锋霉素等处理比较均达到了极显著水平。其中，利福平的未污染率从对照

12、的19.45%上升到68.42%，成活率从16.67%上升到65.79%，说明利福平和氯霉素均能较有效地抑制内源细菌的污染，而其他抗生素的效果较差，特别是庆大霉素的处理与对照相似。,表5不同抗生素种类对玛丽安万年青茎段培养污染防止的影响（浓度均为50mg.L-1）,注：*方差分析中小写字母表示0.05（显著）水平;大写字母表示0.01（极显著）水平，下同.,2.7不同浓度的氯霉素、利福平对玛丽安万年青茎段培养污染防止的效果 从表6可以看出，随氯霉素（缩写为Chl.）和利福平（缩写为Rif.）浓度的增加，未污染率和成活率均有增加的趋势，当利福平的浓度为150mg.L-1时的未污染率和成活率都达到

13、76.92%，而氯霉素浓度为150mg.L-1时对污染的防止效果达64.10%。,表6 不同浓度的氯霉素、利福平对玛丽安万年青茎段培养污染防止的效果,2.8不同浓度的氯霉素、利福平组合对玛丽安万年青茎段培养污染防止的效果 从表7 可以看出，当氯霉素浓度达到50mg.L-1时，不论利福平浓度是25mg.L-1还是50mg.L-1，防止污染的效果与成活情况均极显著地高于利福平单独处理；而当氯霉素浓度为25mg.L-1时，不管利福平浓度是25mg.L-1还是50mg.L-1，防止污染的效果与成活情况都与对照没有显著性差异。因此，加入培养基的氯霉素浓度应不低于50mg.L-1。,表7 不同浓度的氯霉素

14、、利福平组合对玛丽安万年青茎段培养污染防止的影响,3讨论,内源细菌污染在植物组织培养中较难解决，无论用何种表面消毒方法都无法彻底消除外植体的内生细菌，在培养基加入抗生素是防止内源细菌污染的有效措施之一。 我们的实验结果表明，预处理中ANB2的抑菌效果优于其他抗生素， 添加浓度分别为300、400和500 mg.L-1 的ANB2对材料抑菌效果没有明显的差异，从成本上看，一般应选用300 mg.L-1的ANB2;对较难灭菌或组织较老的材料可使用较高浓度，而对于组织较嫩的材料则可使用稍低一些的浓度；进行减压处理相对于常规处理有明显的抑菌效果，但加入抗生素后再进行减压处理，抗生素则未能取得明显的效果

15、，并对外植体有杀死作用；在7种抗生素中以利福平和氯霉素防止污染效果较好，利福平和氯霉素的浓度均为150mg.L-1时污染防止的效果最佳。,至于使用哪种抗生素为好、使用浓度多少为适宜？可能因植物的种类不同、植物所含内生菌种类的不同以及抗生素使用的种类和浓度不同，导致抗生素使用的效果变化很大。如报道的500mg.L-1头孢噻肟（cefoxitin）、10 mg.L-1阿霉素（amycacin）、30 mg.L-1利福平、50mg.ml-1卡拉霉素、先锋霉素、链霉素、庆大霉素、林可霉素，分别有效地抑制各培养中的细菌污染。 我们发现，25mg.L-1利福平+50mg.L-1氯霉素和50mg.L-1利福

16、平+50mg.L-1氯霉素组合，防止污染的效果比利福平单独处理有很大的提高，与翟建中、Reed的结果相似。表明在培养基中使用两种或两种以上抗生素，可以防治细菌的抗药性，有时效果比单独使用时更好。,参考文献,1 周俊辉.植物快速繁殖技术中存在的问题与对策J.仲恺农业技术学院学报, 1999,12(4):64- 70. 2 LEIFERT C,WAITES W M. Contaminants of plant tissue culturesJ. Int Assoc Plant Tissue Culture Newsl,1990, 60:2-13. 3 周俊辉,周厚高,刘花全.植物组织培养中的内生细

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