载体构建流程ppt课件

1、经典载体构建过程、1、I载体构建过程、cDNA、提取mRNA、目标基因、RT、PCR、PCR产品纯化、酶切对象基因和载体、纯化酶切产品、连接RNA操作区域要保持清洁，定期消毒。在操作过程中，必须经常更换戴口罩和手套的手、胳膊上的细菌和真菌、人体自身分泌的RNA酶，以免被带到试管或污染工具。操作过程中使用的器材都要经过特殊处理。一次性枪头、离心管等塑料产品连续使用灭菌两次，消灭RNA酶。斗牛180，4小时。4，RT，真核基因是通过未加密的内含子分离ORF的中断基因，因此如果把基因组作为模板PCR获得的片段向矢量复制，就不能从原核细胞中剪切内含子，也不能从非实体真核细胞中准确地剪切。(阿尔伯特爱因

2、斯坦，Northern Exposure，原核细胞)因此，要复制真核蛋白基因，必须使用没有内含子的连续编码mRNA作为模板。PCR耐热酶不能直接用模板扩增mRNA，必须通过逆转录酶将mRNA逆转为cDNA，然后用模板扩增cDNA的基因。根据目的，有5，6，PCR三种讲义选择，5，6，PCR可以获得目的基因，第一次开始接触条件时，先制作梯度PCR，选择最合适的条件。这一阶段是为了获得正确的目的基因，因此避免PCR突变尤为重要。其中采取的措施包括使用高保真酶，调节循环次数300cycle左右，合理设计底漆等。，非特异性扩增带发生：PCR扩增后出现的带与预期大小不一致，大或小，特异性扩增带和非特异性

3、扩增带3。没有带，9，解决方法，假阳性的原因和解决方法：讲义设计可能不合适。选择的扩增序列有非目的扩增序列和动员性。靶序列太短或讲义太短，容易产生假阳性。必须重新设计讲义。也有靶标序列或扩增产物的交叉污染。出现非特异性带的原因是引物与靶序列不完全互补，或引物聚合形成二聚体。第二，Mg2离子浓度过高，退火温度过低，PCR循环次数过多。其次是酶的质量和数量。某些来源的酶容易产生非特异性带，其他来源的酶不出现。酶的杨怡太多，有时会出现非特异性的扩增。对策是必要时重新设计底漆。减少酶的数量或改变其他来源的酶。减少讲义量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用2温度点法(93变性，65左右

4、退火和扩张)。没有任何带子。原因可能是少放东西，酶已经消失，或者退火温度太高。解决方法：确认物品放得少，换酶，降低退火温度，做渐变，摸条件。10，PCR产物纯化，如果直接酶化PCR产物，系统中的杂蛋白，离子等会引起酶的困难或星形活性，剩下的聚合酶也会填补粘性末端，复制失败。因此，这一阶段对整个分子克隆非常重要，可以提取苯酚，柱纯化，必要时用胶回收。11，酶切目的基因和载体，12，酶切注意事项，两种酶切条件不同的话，分别切两次酶，纯化后切。温度要求不同，请先将低温要求切成酶，将高温要求切成片。盐浓度要求不同的话，首先要将低盐浓度要求切成酶，然后将高盐浓度切成酶。只要其中一种酶需要添加BSA，就必

5、须在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不影响恩多核酸酶的活性。将甘油的最终浓度控制在10%以下，注意不要发生星号活性，以增加反应体系总体积的方法来达到这一要求。13、酶切的一般问题，14、精制酶切产品，一般需要此阶段，通过未精制酶切产品连接后获得的阳性克隆远远低于塑料回收酶切产品生成的阳性克隆。这一阶段的目的是去除不必要的片段，获得单个纯化的目的基因和载体骨架，避免受到其他序列的干扰。另外，在切酶纯化之前，要进行热灭，以防止剩下的限制性内切酶干扰后续连接反应。降低阳性率。15，回收前，回收后，酶切目的条带，酶切载体带，16，连接，DNA中相邻的5磷酸基与3羟基末端之间形成磷酸二酯键，从而密封D

6、NA切口，或连接两个DNA分子或片段。PCR产品最好纯化明胶回收，以去除PCR产品中的非特异性碎片和底漆等杂质。回收PCR产品时，DNA暴露在紫外线下的时间太长，不能形成嘧啶二聚体，防止PCR产品连接。凝胶电泳检测纯化的PCR产物的浓度，优化连接反应时，插入片段和载体摩尔比为2:11033601(通常为：1)。PCR产品和载体应尽量避免重复的董洁融化。否则，3末残基的损失很容易发生。一般25度2小时，16，4连接在一起过夜。17，18，转换，基本步骤：(1)在冰上解冻100l感觉细胞。(2)将5l连接产物放入感觉细胞，轻轻旋转几次，混合内容物。在冰上放30分钟。(3)将管道放入预先加热到42的

7、水箱中，热击90秒。将管子迅速移到冰浴中，使细胞冷却12分钟。(4)每管700l LB培养基，37振动培养1小时，复苏。(5)室温4，000rpm离心5分钟，清除上清后，用剩下的100l培养基底中显细胞，并将其涂抹在有恒星的LB琼脂平板表面。注：细胞使用量应根据连接效率和感觉细胞效率进行调整。(6)在室温下放置板，直到液体被吸收。(7)倒置的盘子37小时后培养，1216小时后菌落可能出现。19，殖民地PCR，这一阶段适应现代分子生物学研究所大量工作的效率，通常直接选择反菌群作为模板进行常规PCR，可以初步检测阳性复制。预备检验菌的良性克隆接种为后续酶切分析及测序检查提取质粒。20，酶切检查阳性克隆，细菌检查的阳性克隆结果质粒进行酶分析，获得预期带是阳性克隆。要进一步确定是否有因PCR引起的点突变、插入、缺失等改变目的基因的序列，就要对阳性复制进行测序。选择性酶通常是设计讲义的两种酶。因为可以完全切除ORF和载体骨架，以条纹大小判断良性复制。(阿尔伯特爱因斯坦，北境外，女性)，21，在测序中选择阳性克隆，排序是构建载体的最后一个关键环节，只有正