第三章-培养基

1、第三章 培养基,第一节 微生物与培养基,微生物的特点,食谱广、胃口大,营养物质：能够满足微生物机体生长、繁殖和完成各种生理活动所需的物质,营养：微生物获得和利用营养物质的过程,营养物质 是微生物生存的物质基础，而 营养 是生物维持和延续其生命形式的一种生理过程。,一、微生物细胞的化学组成,微生物细胞,水：70%-90%,干物质,有机物 蛋白质、糖、脂、核酸、 维生素等及其降解产物,无机物（盐）,微生物、动物、植物之间存在“营养上的统一性”,细胞化学元素组成：,主要元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙、铁等； 微量元素：锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等。,组成微生物细胞的各类化学

2、元素的比例 常因微生物种类的不同而不同,Eg. 细菌、酵母菌和真菌的碳、氢、氧、氮、磷、硫六种元素的含量就有差别。,硫细菌(sulfur bacteria)、铁细菌(iron bacteria)和海洋细菌(marine bacteria)相对于其他细菌则含有较多的硫、铁和钠、氯等元素, 硅藻(Diatom)需要硅酸来构建富含(SiO2)n的细胞壁。,二、微生物的六类营养要素,微生物、动物、植物之间存在“营养上的统一性”,在元素水平上都需20种左右， 且以碳、氢、氧、氮、硫、磷6种元素为主； 在营养要素水平上则都在六大类的范围内， 即碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水。,微生物与动植物营养要

3、素的比较,三、培养基的成分,培养基的影响：菌体生长、产物合成、产品的分离精制、产品的产量和质量等。,培养基（medium）是人工配制的、供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需的多种营养物质的混合物。,（一）碳源（carbon source） 1. 定义,一切能满足微生物生长繁殖所需碳元素的营养物，称为碳源。,微生物细胞含碳量约占干重的50，除水分外，碳源是需要量最大的营养物，又称之为大量营养物（macronutrients）。,如把微生物作为一个整体来看，其可利用的碳源范围即碳源谱。,碳源谱（spectrum of carbon sources）：,从元素水平、化合物水平直至培养基原料水平

4、来考察碳源，可见其数目是逐级扩大的甚至可多到无法计算。,凡以无机碳源作主要碳源的微生物，则是种类较 少的自养微生物。,凡必须利用有机碳源的微生物，就是为数众多的异养微生物。,碳源谱,有机碳,无机碳,对一切异养微生物来说，其碳源同时又兼作能源，这种碳源称为双功能营养物（difunctional nutrient）。,微生物的碳源物质很多，有糖类及其衍生物、有机酸类、醇类、脂类、烃类、蛋白质及其降解产物等。,2. 种类,Eg. 假单胞杆菌属的一些菌能利用90多种不同的碳源物质。 甲烷氧化菌只能利用甲烷和甲醇作碳源。,不同种类的微生物对碳源的利用能力也不一样！,单糖双糖和多糖 己糖 戊糖 葡萄糖、果

5、糖 甘露糖、半乳糖 淀粉 纤维素或几丁质等纯多糖 纯多糖 琼脂等杂多糖,葡萄糖可作为大多数微生物的碳源！,（1）糖,（2）酚、氰化物等有毒物质,对人类有毒的物质Eg. 酚、氰化物等,某些微生物Eg. 诺卡氏菌和一些霉菌等,美味佳肴,微生物清除三废,（3）CO2,最廉价的、用之不尽的碳源，是自养微生物唯一或主要的碳源。,Eg. 生长在动物血液、组织和肠道中的致病细菌（沙门氏菌 、李斯特菌等）,（4）纤维素,纤维素是由葡萄糖以1,4糖苷链组成的，在自然界中资源丰富，但大多数动物和人不能直接利用，而某些微生物可用其作为碳源来生产发酵产品。,（5）烃类,烃类化合物也能被微生物用作碳源，且微生物氧化烃类

6、的许多中间产物和最终产物均是重要的工业原料。,清除石油污染,在发酵工业中最常用的碳源是 葡萄糖、淀粉、废糖蜜、 麸皮和米糠等。,3. 功能,（1）构成细胞物质 （2）构成各种代谢产物和细胞贮藏物质 （3）为微生物进行生命活动提供能量,（二）氮源（nitrogen source） 1. 定义,凡能提供微生物生长繁殖所需氮元素的营养源，称为氮源。,氮是构成重要生命物质蛋白质和核酸等的主要元素，氮占细菌干重的1215，也是微生物的主要营养物。,如把微生物作为一个整体来看，其可利用的氮源范围即氮源谱。,氮源谱（ nitrogen of nitrogen sources）：,异养微生物对氮源的利用顺序是

7、： “N.C.H.O”或“N.C.H.O.X” “N.H” “N.O” “N”,2. 种类,微生物能利用的氮源,无机氮,分子氮,有机氮,3.功能,氮源物质一般不提供能量，但也有例外： 硝化细菌，它能利用NH3氧化获得能量，NH3既是氮源又是能源。,构成细胞物质 构成代谢产物,（三）无机盐（mineral salts） 1. 定义,无机盐（mineral salts）或矿质元素主要可为微生物提供除碳、氮源以外的各种重要元素。,大量元素,微量元素,无机盐,（四）水,微生物细胞中水占7090， 水是地球上整个生命系统存在和发展的必要条件！,水在生物体内的作用 （1）水是细胞的重要组成成分。 （2）水

8、直接参与代谢反应，许多反应都涉及脱水和水合。 （3）水是活细胞中各种生化反应的介质。 （4）营养物质、代谢产物都必须溶于水中才能被运输。 （5）水比热高、气化热高、沸点高，又是热的良导体，可调节细胞的温度。 （6）水是维持细胞形态的重要因素。,（五）生长因子（growth factor） 1. 定义,是一类调节微生物正常代谢所必需，但不能用简单的碳、氮源自行合成的需要量很小的一类有机物。,2. 种类,广义的生长因子： 维生素、碱基、卟啉及其衍生物、甾醇、胺类、 C4C6的分枝或直链脂肪酸， 以及需要量较大的氨基酸；,狭义的生长因子： 一般仅指维生素。,在配制微生物培养基时，一般可用生长因子含量

9、丰富的天然物质作原料以保证微生物对它们的需要。 Eg.如果配制的是天然培养基，则可加入 酵母膏（yeast extract）、 玉米浆（cornsteep liquor，一种浸制玉米以制取淀粉后产生的副产品）、 肝浸液（liver infusion）、 麦芽汁（malt extract）、 其他新鲜的动、植物的汁液； 如果配制的是组合培养基，则可加入复合维生素溶液。,（六）前体（precursor） 1. 定义,前体是指在产物的生物合成过程中，被菌体直接用于产物合成而自身结构无显著改变的物质。,（六）促进剂（accelerant） 1. 定义,促进剂，是指那些细胞生长非必需的，但加入后却能显著

10、提高发酵产量的一些物质，常以添加剂的形式加入发酵培养基中。,四、配制工业发酵培养基的基本要求,1.满足菌体生长及产物合成。 2.理化性质稳定。 3.黏度适中。 4.原材料主要要有利于产物合成。 5.不影响通气搅拌和产物的分离精制 6.因地制宜，质优价廉。,第二节 培养基的种类,按培养基的组成成分分类 按培养基的物理状态分类 按培养基的功能分类,一、各种分类方法,按成分不同划分,天然培养基,合成培养基,半合成培养基,按培养基成分划分,天然培养基 采用化学成分还不清楚或化学成分不恒定的各种植物和动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质(例如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨等)制成的。,合成培养基 是用

11、化学成分和数量完全了解的物质配制而成的。成分精确，重复性强，可以减少不能控制的因素。 适用于在实验室范围作有关营养、代谢、分类鉴定、生物测定及选育菌种、遗传分析等定量研究工作。 但一般微生物在合成培养基上生长较慢，有些微生物营养要求复杂，在合成培养基上不能生长。,半合成培养基 多数培养基配制是采用一部分天然有机物作碳源、氮源和生长因子的来源，再适当加入一些化学药品以补充无机盐成分，使其更能充分满足微生物对营养的需要。 大多数微生物都能在此培养基上生长繁殖。因此，在微生物工业生产上和试验研究中被广泛使用。,按物理状态不同划分,固体培养基,液体培养基,半固体培养基,按培养基物理状态划分,液体培养基

12、 常用于大规模的工业生产及生理代谢等基本理论研究工作。 发酵工业多用作培养种子和发酵的培养基。 根据微生物对氧的要求情况，分别作静止或通风搅拌培养。 在菌种筛选工作和菌种培养工作中，也常用液体培养基进行摇瓶培养 微生物在液体培养基中生长的情况有时也可用作鉴定菌种的参考。,生理代谢 菌种筛选,种子培养,发酵培养,固体培养基 分类：斜面试管、平板等 是在液体培养基中加入凝固剂配成的，最常用的凝固剂是琼脂。,作用： 固体培养基在菌种的分离、保藏、菌落特征的观察、活菌计数和鉴定菌种方面是不可缺少的。 在制曲、酶制剂、柠檬酸等生产中，用来培养霉菌等的固体种子和发酵培养基，是由麸皮等农作物加无机元素等制成

13、的。,按培养基用途划分,增殖培养基：可以配制成适合某种微生物生长而不适合其他微生物生长，从而达到从自然界分离这种微生物的目的。 选择培养基：选择培养基是根据某种或某一类群微生物的特殊营养需要或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的一类培养基。利用这种培养基可以将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。（抑制） 鉴别培养基：普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反应的指示剂或化学药品，从而产生某种明显的特征性变化，以区别不同的微生物。,二、发酵生产中的培养基种类,工业发酵中培养基往往是依据生产流程和作用分为： 斜面培养基(孢子培养基) 种子培养基 发酵培养基,斜面培养基 包括细菌，酵母等的斜面

14、培养基以及霉菌、放线菌生孢子培养基或麸曲培养基等。 这类培养基主要作用是使产孢子微生物产生大量的优质孢子，或使不产孢子微生物如大肠杆菌、酵母细胞活化、生长繁殖。,特点： 1.对于大肠杆菌或酵母细胞斜面培养基，富含有机氮源，少含或不含糖分。有机氮有利于菌体的生长繁殖，能获得更多的细胞。 2.对于放线菌或霉菌的产孢子培养基，则基质浓度要低些，否则容易长菌丝而较少形成孢子。 3.斜面培养基中宜加少量无机盐类，供给必要的生长因子和微量元素。,种子培养基(包括摇瓶种子和小罐种子培养基) 培养种子的目的： 1.扩大培养，增加细胞或菌丝体数量； 2.同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞或菌丝体。,种子培

15、养基特点： 1.必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子。 2.种子培养基中各种营养物质的浓度不必太高。供孢子发芽生长用的种子培养基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源。 3.种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。,发酵培养基 发酵培养基是发酵生产中最主要的培养基，它不仅耗用大量的原材料，而且也是决定发酵生产成功与否的重要因素。 （1）根据产物合成的特点来设计培养基： 对菌体生长与产物合成相偶联的发酵类型，充分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。 对菌体生长与产物合成不相偶联的发酵类型，既要考虑前期细胞的生长繁殖，还要考虑后期目标产物的代谢合成，一般在产物

16、合成时需要添加某些成分。,（2）发酵培养基的各种营养物质的浓度应尽可能高些，这样在同等或相近的转化率条件下有利于提高单位容积发酵罐的利用率，增加经济效益。 （3）发酵培养基需耗用大量原料，因此，原料来源、原材料的质量以及价格等必须予以重视。,第三节,影响培养基质量的因素 培养基的设计 培养基的筛选,一、影响培养基质量的因素,原材料的质量 水质 灭菌的影响 糖类在高温条件下易被破坏，特别是还原糖与氨基酸、肽类或蛋白质等有机氮源一起加热时更易反应，形成棕色物质。 类还可以与磷酸盐产生络合反应。 pH 其他因素,二、培养基的设计,原则：满足菌体细胞生长繁殖和合成代谢产物的元素要求，还要提供维持细胞生

17、命活动和合成代谢所需的能量。 1.首先必须做好调查研究工作 （1）了解菌种的来源、生活习性、生理生化特性和一般的营养要求。 工业生产主要应用细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类微生物。它们对营养的要求既有共性，也有各自的特性，应根据不同类型微生物的生理特性考虑培养基的组成。,（2）了解生产菌种的细胞元素组成和基本的培养条件。 （3）了解对代谢产物的元素组成、分子结构、化学性质、生物合成途径、一般提取方法和产品质量要求等也需。 （4）考虑所采用的发酵设备和工艺条件、原材料的来源。,2、设计基础培养基的组成,基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基。 LB培养基是一种应用最广泛和最

18、普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。 根据前期调研工作设计出基础培养基。 通过实验来摸索菌种对各种主要碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物的能力。,3、考察原材料的配比关系,（1）碳氮比：一般指培养基中元素碳与元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比。 如在微生物的谷氨酸发酵中，培养基的CN为4：l时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；当CN为3：1时，菌体繁殖受抑制，而谷氨酸大量增加。 （2）生理酸性物质与生理碱性物质的比例,4.确定重要金属离子和非金属离子对发酵的影响 考虑菌体对各种无机元素的营养要求，试验其最高、最低和最适用量。 5.考虑其它因素 考虑生长因子、前体、

19、诱导物、阻遏物、消沫剂对发酵的影响。,三、培养基的筛选,通过单因子实验法、正交实验设计、响应面分析、遗传算法设计等来选择培养基中使用的原材料种类和浓度配比。,小 结,1掌握培养基成分及其功用 2. 掌握发酵培养基的分类 3掌握培养基设计的一般原则 4了解有关培养基质量的影响因素,back2,细胞湿重(wet weight)与干重(dry weight)之差为细胞含水量， 常以百分率表示：湿重-干重/湿重100% 。,水是细胞维持正常生命活动所必不可少的， 一般可占细胞重量的7090%。,湿重：将细胞外表面所吸附的水份除去后称量所得重量，一般以单位培养液中所含细胞重量表示 （克/升或毫克/毫升）

20、。,干重：采用高温（105）烘干、低温真空干燥和红外线快速烘干等方法将细胞干燥至恒重即为。,微生物细胞中几种主要元素的含量（干重%）,back1,back2,细胞湿重(wet weight)与干重(dry weight)之差为细胞含水量， 常以百分率表示：湿重-干重/湿重100% 。,水是细胞维持正常生命活动所必不可少的， 一般可占细胞重量的7090%。,湿重：将细胞外表面所吸附的水份除去后称量所得重量，一般以单位培养液中所含细胞重量表示 （克/升或毫克/毫升）。,干重：采用高温（105）烘干、低温真空干燥和红外线快速烘干等方法将细胞干燥至恒重即为。,back3,微生物能利用的碳源类型 大大超过了动物界或植物界所能利用的碳化合物。,宝贵的氮源 “C.H.O.N”和“C.H.O.N.X”型，尽量避免将之作为廉价的碳源使用。,异养微生物在元素水平上的最适碳源 “C.H.O”型,back4,微生物能利用的氮源类型也明显比动物或植物的广。,a.有机氮,主要由蛋白质及蛋白质的各种降解产物 蛋白胨、氨基酸、小肽和尿素等。,实验室常用的有机氮源有： 牛肉膏、蛋白胨、酵母