DNA重组技术的基本工具(附模拟操作图)

1、选修3,个体水平,细胞水平,分子水平,知识点一、基因工程概念,基因工程：又叫基因拼接技术或DNA重组技术。就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰和改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向的改变生物的遗传性状。,原理:,基因重组,定向改造生物,优点:,1.1944年艾弗里(O.Avery)等进行了肺炎双球菌体外转化实验,证明了DNA是生物的遗传物质,并且证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体,成为基因工程的先导,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,20世纪中叶，基础理论取得了重大突破,2.1953年沃森和克里克建立了双螺旋结构模型,使生物学进入分子水平。

2、,1958年梅塞尔松和斯塔尔,以大肠杆菌为实验材料,运用同位素示踪技术,用实验证明了DNA的复制是以半保留方式进行的.,1957年克里克提出中心法则的确立,3.1963年尼伦伯格和马太做蛋白质体外合成实验,破译编码氨基酸的遗传密码.,1)基因转移载体的发现 2)工具酶的发现 3)DNA合成和测序技术的发明,技术发明命使基因工程的实施成为可能,1967年罗思和赫林斯基发现细菌质粒有自我复制能力,为基因转移找到一种运载工具.,1970年阿尔伯(W.Arber)、内森斯(D,Nathans)、史密斯(H.C.Smith)细菌中发现了第一个限制酶,1977年科学家又发明了DNA序列分析方法,1965年

3、桑格发明了氨基酸序列分析技术,4) DNA体外重组的实现,1972年伯格(P.Berg)首先在体外进行了DNA改造的研究,成功地构建了第一个人工体外重组DNA分子.,1973年博耶和科恩使重组DNA转入大肠杆菌中,转录出相应的mRNA,并使外源基因可以在原核细胞中成功表达,至此表明基因工程正式问世.,（5）重组DNA表达实验的成功,1980年第一个转基因小鼠问世,1982年采用显微注射技术培养目出”超级小鼠”,1983年培育出第一例转基因烟草,（6）第一例转基因动物问世,1988年穆里斯发明了PCR技术,使基因工程技术得到了进一步的发展和完善.获1993年诺贝尔化学奖,1993年中国农业科学院

4、的科学成功之路地培育出抗棉铃虫的转基因抗虫棉,（7）PCR技术的发明,1、限制性核酸内切酶（限制酶）,(1).分布： (2).特点： (3).举例：,主要在微生物中。,专一性和特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。,大肠杆菌的一种限制酶（EcoR）能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开,限制性内切酶（EcoR）作用过程,磷酸二酯键,（4）作用于：,DNA :磷酸二酯键,限制性核酸内酶,（专一性）,一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。,限制性核酸内切酶,EcoR,黏性末端,黏性末端,中心轴线两侧切开,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切

5、口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,Sma,平末端平末端,中心轴线处切开,5、结果：,产生黏性未端和平末端,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶,Q :限制酶所识别的序列 有什么特点?,以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称重复排列,Q.怎么样让切出来的两个黏性末端可以重合?,用同一种限制酶切切割目的基因和运载体,大肠杆菌中的EcoR限制酶,Q.怎么样切才能让两个不同的可以重合?,用DNA连接酶,2、基因的“针线” DNA连接酶 连接酶的作用： 将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。 连接的部位： 生成磷酸二酯键 DNA连接酶的作用过程

6、：,类型：,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和 平末端,DNA连接酶,DNA聚合酶 VS. DNA连接酶,DNA聚合酶 VS. DNA连接酶,单个脱氧核苷酸,DNA片段,DNA复制,DNA重组,均作用于磷酸二酯键,运载体,1、种类,质粒：存在于许多细菌和酵母菌等生物中,是细胞核或拟核外能够自主复制的很小的环状DNA分子。,都有侵染或进入宿主细胞的能力,标记基因，便于进行检测。,1.能够在宿主细胞中_。 2.具_，以便与外源基因连接。 3.具有某些_，便于进行_。 如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。,复制并稳

7、定地保存,多个限制酶切点,标记基因,筛选,运载体,Q:作为运载体必须具备哪些条件？,重组DNA分子的模拟操作,ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG,用剪刀(代表EcoR)进行DNA”切割”.将白色纸板上的目的基因,重组到红色纸板的质粒中.用双面胶(代表DNA连接酶)将切口黏结起来,就完成了一个重组DNA分子的模拟制作,ATAGCATGCTATCCATG TATCGTACGATAGGTACTTAA,AATTCGGCATAC GCCGTATG,AATTCTC TATG GAG ATACTTAA,TCCTAG AGGA

8、TCTTAA,AATTCCATAC GGTATG,TCCTAGAATTCTC TATGAATTCCATAC AGGATCTTAAGAG ATACTTAAGGTATG,TCCTAGAATTCTC TATGAATTCCATAC AGGATCTTAAGAG ATACTTAAGGTATG,TCCTAGAATTCTC TATGAATTCCATAC AGGATCTTAAGAG ATACTTAAGGTATG,TCCTAGAATTCTC TATGAATTCCATAC AGGATCTTAAGAG ATACTTAAGGTATG,TCCTAGAATTCTC TATGAATTCCATAC AGGATCTTAAGAG

9、ATACTTAAGGTATG,TCCTAGAATTCTC TATGAATTCCATAC AGGATCTTAAGAG ATACTTAAGGTATG,TCCTAGAATTCTC TATGAATTCCATAC AGGATCTTAAGAG ATACTTAAGGTATG,TCCTAGAATTCTC TATGAATTCCATAC AGGATCTTAAGAG ATACTTAAGGTATG, ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG, ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG, ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG, ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG, ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG, ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC