流式细胞术样品制备(完整)ppt课件

1、1、流式细胞术样品制备，2，FCM的样品制备包括单分散细胞悬浮制备技术、细胞生物学特性标记技术和荧光染色技术，FCM是一种可以定量测量细胞或细胞器的结构和某些功能，并根据细胞子集的特性进行分类的技术。FCM的实验对象是单细胞或单核的显液，在FCM技术中，制作合格的单细胞显液是非常重要的部分，这种单细胞显液主要来自单细胞、血液、脱落细胞、实体组织、石蜡包埋组织等。3，1、1、1、1、1、1、1、1、1、1、1、3、3、3、3、3、3、3 2。放入少量0.25%胰酶，消化细胞，反向显微镜观察。看到细胞稍微变圆后，立即停止消化(如果含有10%的燃烧血清培养基)，收集细胞，离心后上清，用PBS液体清洗

2、细胞一次，从离心中去除上清液，约0 .3.如果不及时检查机器，就要固定细胞，通常固定液要用70%的乙醇保存在4冰箱里。4，(b)悬浮培养细胞单细胞显液准备程序：1，离心除球培养液，PBS液清洗细胞一次，离心除相清液，约0.5ml细胞显液，用振荡器分散细胞。2.如果不及时检查机器，就要固定细胞，通常固定液要用70%的乙醇保存在4冰箱里。5，2，实体组织单分散细胞的制备新鲜实体组织新鲜实体组织是根据手术或活检后检查目的采集的样品，该样品应及时进行适当的保存处理。例如，要及时固定剂或低温保存组织，防止室温太高，放置时间过长，组织自行溶解，不影响检查结果。6，新鲜实体组织单细胞显液的制备方法如下。酶消

3、化法机械法切割法网抛光法化学试剂处理法，7，酶消化法酶主要在实体组织分散作用原理上有三个方面。一种是可以破坏组织间胶原蛋白。第二，是能分解组织细胞的紧密连接装置的蛋白质性物质。第三，可以水解组织间的粘多糖物质。酶消化法是实体组织分布在单细胞中的主要方法，常用的酶类试剂是蛋白酶类(如胃蛋白、木瓜蛋白酶、链蛋白、中性蛋白等)，能释放所有组织的细胞。胰蛋白酶、水解脂肪结合和肽结合；胶原可以分解多种分子类型的胶原蛋白。溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷结合。弹性蛋白可以用来消化连接组织糖蛋白和弹性蛋白的纤维，从而使血管、心脏和肝脏的细胞解体。8，为了分散组织细胞，酶法的应用需要注意条件的选择和影响因素。必须

4、指出，酶必须溶解在适当的溶液中，用于组织分散的许多酶并不纯。必须指出，不仅含有支配酶，在其他程度上也混合了其他污染物质，有助于组织的分散，对组织的结构或功能有不利影响。9，酶法的一般程序：将适合酶消化的组织放入离心管。将选定的酶溶液1-2毫升放入包含消化组织的试管。通常要消化20-30分钟(恒温37C或室温)，在消化过程中间接振动或吹。完成消化，收集细胞显液，用尼龙网(200目)过滤，去除大块，用低速离心力去除细胞碎片。对准备好的单细胞进行流式细胞术分析或保存。，10，机器法机器法分裂实体组织用剪刀剪或用锋利的解剖刀切碎，用匀浆机均匀，用细注射针吸入细胞，分散细胞，用网搓也能得到大量细胞。机械

5、法在细胞显液中容易产生细胞碎片，因此机械法经常与其他方法一起使用。11，一些常用的机械准备过程如下：切割方法：在扁平碟子中加入组织块，加入少量盐水。用剪刀均匀地切割组织。加入10毫升生理盐水。用吸管吸出组织菌，先用100颈尼龙网过滤到试管里。离心沉淀为1000prm3-5分钟，用生理盐水再洗3次，用短时间低速离心沉淀(500-800prm)去除细胞碎片。300网状尼龙网过滤去除细胞团。固定70%的冰乙醇，放4个冰箱。12，网搓法：将100个铜网绑在小烧杯上。把切好的组织放到网上，用眼和镊子轻轻地揉搓组织块，用生理盐水冲洗，直到搓出组织为止。(David aser，Northern Exposu

6、re，季节)300目的用尼龙网过滤细胞显液，去除大块，收集细胞显液，用离心沉淀1000prm，5分钟。70%乙醇固定，4冰箱准备。13，研磨法准备70ml组织研磨机，将组织切成小块。放入组织研磨器，加入1-2毫升生理盐水。转动研究棒，研究均匀化就行了。加入10-20毫升生理盐水后清洗机。收集细胞显液，经过300颈部尼龙网，用离心沉积500-800prm，1-2分钟，生理盐水冲洗三次，保持离心沉积。14，化学试剂处理法化学试剂处理法的主要原理是，通过替换具有细胞间粘附作用的钙镁离子来分散细胞。试剂赵霁：准备0.2 EDTA0.2g溶解后，加入100毫升汉克斯液，封装高压消毒，然后以0-4保存。胰

7、酶和EDTA制备了胰酶0.25g PBS(PH7.0)200ml，浓度0.125%，EDTA0.2g PBS(PH7.0)200ml，浓度0.2%。各取40毫升混合，保存化妆水冰箱，使用时过滤即可。15，实验阶段：将组织切成薄片，放入试管。EDTA液5毫升，室温，30分钟，扔掉。加入胰酶EDTA液5-10毫升，在37恒温水浴中间歇振荡3-5次，30分钟。用300颈部尼龙网过滤，离心沉积1000prm，5分钟，生理盐水2-3次，离心500-800prm，1-2分钟。70%的乙醇被固定在冰箱里检查。16，实验证明，用化学试剂处理组织可以降低细胞存活率，细胞产量低，细胞碎片和细胞团的杨怡不稳定，因此

8、化学试剂处理方法不能单独使用，可以与其他方法一起使用。机械法经常导致严重的细胞损伤，细胞产量低，细胞碎片不影响FCM检查结果，必须用适当的方法去除碎片或最小化碎片。酶法适用于实体肿瘤的分散解体，但对测量的化学成分可能产生不利影响，因此，根据使用目的，选择合适的单细胞悬液制备方法，才能获得理想的样品和更好的FCM结果。17，注意事项：新鲜组织标本要及时保存，以免组织在室温下放置太久。这可能导致细胞自行溶解，DNA分解，影响FCM测量结果。根据实验目的，采用最佳的细胞固定方法，防止固定剂的原因导致FCM检查结果不稳定。酶法应注意条件的选择和影响因素、酶的溶剂、消化时间、pH值、浓度等对酶消化法的影

9、响。细胞丰富的肿瘤(淋巴瘤、视神经母细胞瘤、脑肿瘤、未分化癌、骨髓癌、部分软组织肉瘤)等多种组织不需要使用酶或化学方法，经常可以通过单独的机械方法接收大量的单分散细胞。使用酶法时，要重视食管癌、乳腺癌、皮肤癌等结缔组织较多的肿瘤等酶的选择。因为胶原蛋白具有Ca2，Mg 2存在，或在血清状态下活性不下降的特征。18，实验方法：石蜡包埋组织从切片机中切割40-50米厚的组织板3-5块。把切下来的组织切片放进试管。二甲苯5-8毫升脱蜡(室温下)，1-2天，根据是否脱蜡，可以更换一次二甲苯，除蜡后扔掉二甲苯。水合：100%，95%，70%，50%渐变酒精5毫升，每10分钟去除乙醇，加入蒸馏水3-5毫升

10、，10分钟后扔掉。消化：加入胃蛋白2ml 0.5% (pH值1.5-2.0)，在37恒温水浴中消化30分钟，消化过程中每10分钟振动一次。石蜡包埋组织单细胞显液的制备，19，消化30分钟后立即加入生理盐水结束消化。经过300颈部尼龙网过滤，未消化的组织片可以进行二次消化。收集细胞悬液，离心沉淀1500prm，用生理盐水冲洗1 2次，用离心沉淀冲洗1500prm，用生理盐水冲洗1 2次，用离心沉淀沉淀500-800prm，去除碎片。准备的单细胞显液要涂上涂层，AO染色要用荧光显微镜观察，完整的细胞核，细胞核要释放黄绿色荧光。放入单细胞样本1106细胞/ml、荧光染色液乙烯(EB)或碘化丙烷(PI

11、)1毫升，安装0-4冰箱30分钟，用300颈尼龙网过滤，然后在机器上检查。20，注意事项：必须将石蜡从组织中清除干净，确认石蜡脱净的方法是扔掉二甲苯，添加100%乙醇，为了防止已经释放的核被消化，消化时间太长，渡边杏。切片太薄或太厚会渡边杏，太薄会增加碎片，影响流式分析结果，太厚，脱蜡不纯或脱蜡时间太长，一般适合40-50米。21，2，血液单细胞样本的准备血液是天然单细胞分散细胞显液，血液中的细胞成分具有在生理状态下分布的自由状态。这是流式细胞分析的最佳样本，全血中含有红细胞、白细胞、血小板等三种类型的成分，但流式细胞检测以一组细胞为对象，因此必须在检查前进行测量，22，用淋巴细胞的制备肝素抗

12、凝2.0毫升，生理盐水2毫升，将全血稀释4毫升。首先将3ml淋巴细胞分离液放入另一个离心管，然后沿着试管内壁在分离面上方慢慢添加稀释后的血液。不要用力过猛。保持明确的分层状态，以免血液和分离液混合。离心2000prm，30分钟，室温18-20，离心后试管内的血液明显分为4层，上层为血浆层，中间层为分离液层(淋巴细胞所在位置在血浆层和分离液层中间)，下层为红细胞，红细胞为粒细胞。用吸管吸除上层和中间层之间的淋巴细胞，收集另一个离心管，用生理盐水稀释到10毫升，进行离心洗涤2次，每次1500prm，10分钟，放弃上清，就能获得纯度高的淋巴细胞，但可能有少量单核细胞。70%冰乙醇固定，4冰箱保存。2

13、3，粒细胞的制备用淋巴细胞分离液对细胞分层。粒细胞的比重比淋巴细胞略大，因此通过分离液分离的颗粒细胞分层在红细胞上，在分离液的底部。用吸管慢慢吸入粒细胞层，放入另一个离心管，用5毫升的汉克液洗3次，每次用离心沉积下沉1500prm，10分钟。吸收粒细胞的同时，还附带红细胞，因此要去除红细胞，加入1.0ml低渗透溶液，30-40秒。再用汉克斯液洗两次，就能得到纯度95%以上的颗粒。24，单核细胞准备1。加入肝素1000u/ml抗凝剂全血3.0m1，3.0ml生理盐水稀释血液，在无菌状态下工作。2.1640培养液10.0毫升，放入培养瓶，将稀释血液放入培养液中混合，与培养瓶的接触面很大。3.放入3

14、7孵化器内孵化30-40分钟，取出培养瓶，丢弃血液，用生理盐水轻轻冲洗培养瓶，去除剩余血液时，培养瓶壁上附着着大量单核细胞。单核细胞在短时间培养基内具有快速的特性，其他细胞没有这种特性，因此利用这种特性缩短，25，4 .消化附着在培养瓶壁上的单核细胞，用0.25%胰酶1015分钟，在室温下持续摇晃，使细胞脱落，单核细胞黏附力强，用酶消化，细胞数量经常少，现在用机械方法5。脱落的细胞转移到离心管，用离心沉积1500prm，5分钟，生理盐水冲洗23次，每离心800prm，2分钟去除碎片杂质。6.涂细胞，用酸橙染色，用荧光显微镜观察形态和纯度。7.用70%乙醇固定细胞，安装0-4冰箱进行准备检查。2

15、6，27，第三，脱落细胞单细胞显液的制备可以从林爽实际工作中收集很多自然脱落的细胞，这种细胞标本通过简单的处理可以获得更好的单分散细胞显液，因此是流式细胞术检查的天然样品，下面介绍几种常见的脱落细胞样品准备方法。宫颈脱落细胞悬液的制备1。首先用生理盐水冲洗宫颈表面的分泌物，用棉轻柔擦拭宫颈表面，用20毫升生理盐水冲洗吸附在棉上的脱落细胞。2.收集细胞显液，用1500prm离心沉淀用生理盐水洗2次，每5分钟放弃清浊，添加70%乙醇3ml固定准备检查。28，食管脱落细胞悬浮液的制备1。用10ml生理盐水冲洗食道网具中的细胞，用1500prm离心沉积2次，离心500-800PRM1-2分钟，放弃上清

16、。2.将细胞数调节到1X106/ml，就可以进行标记染色机。如果不立即检测70%的冰乙醇，则可以固定保管。3.在标记染色之前，如果发现细胞聚集在一起，就可以用0.5%的胃蛋白酶(PH1.5-2.0)，在37万亿至5 10分钟内消化，振动将分散到单细胞显液中。29，胸腹水脱落细胞的制备1。提取胸腹水200-300毫升，加入抗凝剂(肝素或枸橼酸钠)5毫升，将4冰箱放入容器，放置6-12小时，放弃听力。2.留下10-20毫升沉淀液，吸入试管，用生理盐水洗3次，1500prm离心沉淀5分钟。3.离心沉淀后加入5毫升冷柠檬酸缓冲液，在室温下放置20分钟。4.用300网眼筛过滤后，用PBS冲洗柠檬酸缓冲液，用离心沉积法上清，添加70%乙醇固定准备检查。30，内镜刷检查样品单细胞显液制备1。将刷子检查刷子放入10