NG2与少突状胶质细胞

1、在EAE中，NG2与神经炎症、血脑屏障改变、OPCs反应及DCs激活有关,影响因子：12.213 Accepted: 15 March 2016,Moransard 等人研究EAE在NG2KO mice的作用，发现与WT mice并没有发现任何差异 而本作者采用通过样的方法，发现NG2在EAE中发挥着重要的作用,实验方法 工具,1.ELISA-酶联免疫吸附试验 2.EAE 建模方法 3.工具鼠 4.bone marrow chimeramouse 5.血管内皮通透性试验,1.ELISA-酶联免疫吸附试验,OD,2.EAE 建模方法,EAE模型是中枢神经系统内小血管周围出现单核细胞浸润及髓鞘脱失

2、为特征的自身免疫性疾病，是人类多发性硬化（MS）的理想动物模型。 雌鼠 步骤： MOG35-55(200ug)+PBS水溶液100ul H37RA(结核分枝杆菌300ug)+ 然后300ul不完全弗氏佐剂超 声乳化 尾静脉一次每只0.1ml+百日咳病毒（原液400ng/ul) 用PBS稀释使用,每只老鼠腹腔注射0.1ml，第2天注射。,皮下两侧 尾静脉,利用同源重组技术 WT C57Bl/6J mice F1 NG2+/- Mice F2 NG2-/- Mice & NG2+/+ Mice WT Mice 纯合的 NG2KO mice,3.工具鼠,the insertion of a 1100

3、-bp neomycin-resistance,F1,WT,4.bone marrow chimeramouse,骨髓嵌合体小鼠 =淋巴造血系统嵌合体 = 放射性嵌合体 彻底破坏受者机体骨髓的造血系统，最大程度的杀灭肿瘤细胞 骨髓含造血干细胞，血液也有 白血病 同基因型,5.FITC-dextran,血管内皮通透性试验 脑微血管内皮细胞（BMEC）拥有丰富的酶系统，但缺乏收缩蛋白，故正常生理状态下组胺、5-羟色胺、白三烯C4等血管活性物质较少影响血脑屏障 而病理状态下因BMEC酶系统活性改变，活性物质将影响BMEC，从而进一步影响血脑屏障的通透性。 开放的血脑屏障能让大分子如右旋糖酐通过,在E

4、AE中，NG2与神经炎症、血脑屏障改变、OPCs反应及DCs激活有关,Introduction,1.NG2-硫酸软骨素蛋白多糖，OPCs和激活的周细胞表达，NG2、PDGFR 是OPCs（ NG2 cell ）的marker，当其分化成少突状胶质细胞时，这两个marker不表达 CNS损伤时，OPCs反应性增殖，表达NG2的细胞在炎症部位聚集 EAE and MS，急性期，OPC的数量显著增加，在慢性后期中，显著减少 OPCs分化为少突状胶质细胞，促进髓鞘的生成 CNS微血管中，周细胞促进血管生成，促进紧密连接的形成，从而保护BBB通透性和维持内皮细胞屏障的功能； CNS损伤时，充当炎症传感器

5、，免疫监视，执行中性粒细胞 巨噬细胞的功能,2.表明NG2与CNS损伤的炎症息息相关 胶质瘢痕: 由于缺氧、低血糖、感染、中毒等均能引起脑组织的损伤而导致星形胶质细胞增生。反应性星形胶质细胞增生是脑组织损伤的修补反应 减弱星形胶质细胞增生，有利于改善脑缺血后神经功能恢复 胶质瘢痕形成是一个极其 复杂的病理生理过程，包括组织水肿、炎症反应、局 部缺血、谷氨酸受体高反应性、脂质过氧化作用、钙离子超负荷、自由基损伤、反应性星形胶质细胞增生,EAE BBB渗透性改变的疾病 3.NG2 炎症浸润 CNS损伤有关,4.NG2KO mice ，EAE的临床表现型更轻微 Unexpectedly，NG2有助于

6、EAE的发病机制 OPCs及周细胞表达NG2 原因 免疫细胞也表达NG2,Abstract,在成年人的CNS中，OPCs表达NG2 在病理情况下，NG2是周细胞激活的marker EAE BBB渗透性改变的疾病 NG2 炎症浸润 CNS损伤有关,1.在NG2KO mice中诱导EAE的发生 相比WT,NG2KO mice EAE临床评分更轻微 OPCs的数量在EAE诱导后无改变 2.发现NG2在免疫细胞中表达，如T细胞、巨噬细胞 树突状细胞 3.评估了T细胞致脑炎性物质 WT NG2KO mice增殖的致脑炎物质MOG35-55水平相同 However，NG2 KO mice T 细胞反应偏向

7、于Th2型反应 4.是否分泌了炎性因子，联想到DCs，测定IL-12表达情况 NG2KO mice中，IL-12-expressingCD11c+细胞显著减少 更重要的是，在WT mice中，IL-12的表达在CD11c+NG2-cell比CD11c+NG2+cell 要更少 5.是否NG2与免疫系统和CNS水平有关-骨髓嵌合体老鼠 相比接受WT骨髓的mice，接受NG2KO mice骨髓的，EAE症状更轻微,？,研究思路,Results,1.NG2KO mice 的EAE表现型更轻微 2.NG2KO mice骨髓中，EAE相关的炎症更轻微 3.EAE induced NG2KO mice，O

8、PCs的数量无改变 4. EAE induced NG2KO mice，紧密蛋白的连续性分布与BBB功能有关 5.免疫细胞表达NG2 6. NG2KO mice ,T细胞对MOG反应，炎症较少 7. NG2KO mice，IL-12表达较少&NG2参与DC的激活 8.NG2不参与巨噬细胞的极化 9. NG2KO mice ,可调节的免疫反应&保守的BBB导致了EAE轻微的表现型,1.NG2KO mice 的EAE表现型更轻微,A representative of three independent experiments is presented,26/33 100%=78.78%,dise

9、ase incidence (84 4.5 vs. 100 % in WT mice) Disease onset was delayed (13.06 3.66 vs. 8.16 1.71 days for WT mice),A representative of three independent experiments is presented,CD45：血管周浸润的炎性细胞，巨噬细胞 CoII IV :microvessel basal lamina TO-PRO-3：细胞核,脊髓截面染色,小胶质细胞&巨噬细胞,激活的星形胶质细胞,Stress marker-positive cell

10、s,浸润的T细胞,大脑皮层,脊髓,2.NG2KO mice骨髓中，EAE相关的炎症更轻微,EAE相关的促炎性基因的mRNA的表达情况,3.EAE induced NG2KO mice，OPCs的数量无改变,EAE and MS，急性期，OPC的数量显著增加，在慢性后期中，显著减少（脱髓鞘过程中） Whether NG2 缺失影响少突状胶质细胞的免疫反应？ 首先要证明NG2是不存在的或不生成 免疫荧光定量分析OPCs数量 确定PDGFR 确定NG2的确敲除了， 且在NG2KOmice中不表达,EAE,the insertion of a 1100-bp neomycin-resistance,在

11、NG2KO mice中，NG2特异性的信号没有被发现（基于NG2敲除的前提下，理解为没有生成），实验更加严谨-IFN-,EAE,研究NG2缺失,免疫荧光定量分析OPCs数量,MBP:神经纤维 APP:损伤的轴突,4. EAE induced NG2KO mice，紧密蛋白的连续性分布与BBB功能有关,周细胞： 神经血管形成 BBB功能 NG2KO mice 中，是否神经炎症水平降低与血脑屏障特异性改变有关 研究了内皮细胞的紧密连接蛋白 、claudin-5、 occludin（咬合蛋白）的结构和功能的分布 血脑屏障结构和功能的改变与紧密连接蛋白的表达变化有关,Dextran-FITC expe

12、riments 血管内皮通透性试验,NG2KO mice周细胞缺乏NG2影响TJs的动态组合 可替换信号转导途径,5.免疫细胞表达NG2,NG2KO mice，巨噬细胞产生更少的炎性物质，浸润能力减弱 NG2可能与其他炎性细胞浸润CNS有关 ， whether NG2 is expressed in WT mice or not by cells of the systemic immune system. ? T Cell BMDDCs BMDMs,CD3:T Cell CD11c：BMDDs CD11b:BMDMs DAPI：核酸，DNA AT区,?,6. NG2KO mice ,T细胞对

13、MOG反应，炎症较少,是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况 观察T Cell的增殖和细胞因子的表达情况 ConA:+ positive 植物血凝素类多克隆刺激剂，通过细胞表面的CD3- TCR复合体作用于T细胞,对小鼠T细胞增殖作用更强一些 单独anti-CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖，加入anti-CD28作用更强 PLP:- negative MO35-55:EAE,6. NG2KO mice ,T细胞对MOG反应，炎症较少,是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况 观察T Cell的增殖和细胞因子的表达情况 ConA:+ positive 植物血凝素类多克隆刺激剂，通过

14、细胞表面的CD3- TCR复合体作用于T细胞,对小鼠T细胞增殖作用更强一些 单独anti-CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖，加入anti-CD28作用更强 PLP:- negative MO35-55:EAE,6. NG2KO mice ,T细胞对MOG反应，炎症较少,是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况 观察T Cell的增殖和细胞因子的表达情况 ConA:+ positive 植物血凝素类多克隆刺激剂，通过细胞表面的CD3- TCR复合体作用于T细胞,对小鼠T细胞增殖作用更强一些 单独anti-CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖，加入anti-CD28作用更强 PLP:- n

15、egative MO35-55:EAE,6. NG2KO mice ,T细胞对MOG反应，炎症较少,是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况 观察T Cell的增殖和细胞因子的表达情况 ConA:+ positive 植物血凝素类多克隆刺激剂，通过细胞表面的CD3- TCR复合体作用于T细胞,对小鼠T细胞增殖作用更强一些 单独anti-CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖，加入anti-CD28作用更强 PLP:- negative MO35-55:EAE,抑炎,促炎,T 增值情况,ConA-CD3-TCR ConA-NG2-NG2,DCs 髓系DCs：IL-12 Th0 Th1 BMDDCs 淋巴系DCs：IL-4 Th0 Th2,7. NG2KO mice，IL-12表达减少&NG2参与DC的激活,是否IL-12表达与NG2表达有关？,IL