10DNA生物合成ytw.ppt

1、第 九 章 DNA生物合成 周口师范学院生命科学系,主要内容,第一节 DNA的复制 第二节 DNA的损伤与修复 第三节 逆转录和其它复制方式 第四节 DNA的体外复制-PCR,DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservative replication)。,一、概念和实验依据,第一节 DNA的（半保留）复制,半保留复制模型,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。 遗传的保守性，是物种稳定性的分子

2、基础，但不是绝对的。,DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的实验所证明。 该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。然后将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作密度梯度离心，将具有不同密度的DNA分离开。,DNA半保留复制的实验证明：,DNA半保留复制研究实验结果示意图,1） 底物(substrate) 2） 模板(template) 3） 引发体和RNA引物 4） 各种酶系 5) 单链DNA结合蛋白,二、 DNA复制的条件,DNA复制过程中脱氧核糖

3、核苷酸的聚合反应,1） 底物(substrate),以四种脱氧核糖核酸(deoxynucleotide triphosphate)为底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。,DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。,2 ）模板(template),3） 引发体和RNA引物,引物酶(primerase)本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物(primer)，以提供自由的3-OH，使子代DNA链能够开始聚合。引物酶需组装成引发体才能催化RNA引物的合成。,在E.coli中

4、，含有解螺旋酶(DnaB蛋白) 、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA复制起始区域的复合结构被称为引发体(primosome) 。,含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,引发体的组装形成,引物酶催化合成短链RNA引物分子,引物,引物酶,4) DNA复制的酶类,a.引物酶(primase)和引发体(primosome) b.DNA聚合酶 (DNA polymerases) c.DNA连接酶（DNA ligase） d.DNA解螺旋酶 (DNA helicase) e.拓扑异构酶(topoisomerase) (兼具内切酶和连接酶活力

5、，能迅速将DNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。),DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶 ( DNA-dependent DNA polymerase, DDDP ) 简称：DNA-pol 活性： 1. 53 的聚合酶活性 2. 核酸外切酶活性,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,DNA聚合酶的核酸外切酶活性,在原核生物中，目前发现的DNA聚合酶有三种，分别命名为DNA聚合酶（pol ），DNA聚合酶（pol ），DNA聚合酶（pol ），这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。 参与DNA复制的主要是po

6、l 和pol 。,种类和生理功能,pol 由十种亚基组成不对称异源二聚体结构，其中亚基具有53聚合DNA的酶活性，具有复制DNA的功能；而亚基具有35外切酶的活性，与DNA复制的校正功能有关。,pol 的二聚体结构,大肠杆菌DNA聚合酶全酶的结构和功能,延长因子,DNA聚合酶异二聚体,核心酶,校对,引物的结合和识别,促使核心酶二聚化,原核生物三种DNA聚合酶比较,真核生物五种DNA聚合酶,真核生物的DNA聚合酶,DNA连接酶(DNA ligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶,DNA连接酶的连接作用,DNA连接酶催化的条件

7、： 需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi基； 未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的； 需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。,DNA连接酶的作用,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 是基因工程的重要工具酶之一。,解螺旋酶，又称解链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白。 每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。,解螺旋酶(helicase),DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase),人类拓扑异构酶的分子结构,能够松解DNA超螺旋结构的酶,DNA复制过程中正

8、超螺旋的形成,解链过程中正超螺旋的形成,拓扑异构酶的作用特点： 既能水解、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶 拓扑异构酶,分 类：,DNA拓扑异构酶的作用机制,拓扑异构酶：,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。,拓扑异构酶：,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。,单链DNA结合蛋白（single strand binding protein, SSB），又称螺旋反稳蛋白(HDP)，是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。 使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在

9、，即稳定单链DNA，便于其作为模板复制子代DNA；保护单链DNA，避免核酸酶的降解。,5 ）单链DNA结合蛋白,DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点(origin) 。 在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。,1) 有一定的复制起始点,三、DNA的复制的起始点和方式,细菌和酵母菌中DNA复制起始点的碱基序列,大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列,DnaA,DnaB (解螺旋酶),SSB,大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型,习惯上把两个相邻DNA复制起始点之间的距离（或DNA片段）定为一个复制子(replicon) 。

10、 复制子是独立完成复制的功能单位。 DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。,复制子和复制叉,复制起始点与复制子示意图,复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）,DNA复制时，以复制起始点(origin)为中心，向两个方向进行解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。 但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。,2) 双向复制 (bidirectional replication),DNA的双向和单向复制,A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点(termination, ter),DNA的双向复制示意图,参与DNA

11、复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3端自由羟基（3-OH）的RNA作为引物(primer) ，才能开始聚合子代DNA链。 RNA引物的大小，在原核生物中通常为50100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。,3) 需要引物,DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须是35。 由于DNA分子中两条链的走向相反，因此当分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时，子代链的聚合方向也是不同的。,4)半不连续复制(semi-discontinuous replication),领头链 (leading strand

12、),随从链 (lagging strand),DNA的半不连续复制,以35方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为53，这一条链被称为领头链(leading strand)。 以53方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是53，这条链被称为随从链(lagging strand)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,领头链和随从链,由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazaki fragment)

13、。 冈崎片段的大小，在原核生物中约为10002000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。,冈崎片段(Okazaki fragment),四、原核细胞DNA的复制过程,1）复制的起始 2）复制的延长 3）复制的终止,DNA复制的起始阶段，由下列步骤构成。 a. 识别起始点：由解螺旋酶(DnaB蛋白) 、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA复制起始区域形成引发体。 b. 解旋解链：由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。 c. SSB结合：单链DNA结合蛋白（SSB）四聚体结合在两条单链DNA上，形成复制叉。 d. 合成引物：

14、在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3端自由羟基（3-OH）。,1）复制的起始,含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,引发体的组装形成,引物酶催化合成短链RNA引物分子,引物,引物酶,2）复制的延长,复制的延长指在DNA聚合酶催化下，以35方向的亲代DNA链为模板，从53方向聚合子代DNA链。其化学本质是dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，磷酸二酯键不断生成。 在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶；而在真核生物中是DNA聚合酶。,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,

15、dGTP,dATP,dCTP,OH 3,3,DNA复制的延长过程,领头链的合成过程,随从链的合成过程,DNA聚合酶催化领头链和随从链同时合成,DNA复制过程简图,3）复制的终止,在复制过程中形成的RNA引物，需由RNA酶来水解去除； RNA引物水解后遗留的缺口，由DNA聚合酶（原核生物）或DNA聚合酶（真核生物）催化延长缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。 （b）连接冈崎片段，分开子代DNA 在DNA连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的双螺旋DNA长链后分开。,（a）去除引物，填补缺口：,随从链上不连续性片段的连接,五、真核细胞DNA的复制,真核生物

16、DNA复制的特点 真核生物的DNA聚合酶 端粒和端粒酶（telomerase）,真核生物DNA复制的特点,A.真核生物染色体有多个复制起点，称为自主复制序列（ARS）或复制基因(replicator);多复制眼，呈双向复制，多复制子。,C.真核生物DNA复制速度比原核慢，速度为10003000 bp/min (仅为原核生物的1/201/50）。,真核细胞DNA复制的特点, 多个起点复制,G.RPA：真核生物的单链结合蛋白；RNaseH1和MF-1切除RNA引物；DNA聚合酶填补缺口。,E.真核生物有多种DNA聚合酶,DNA聚合酶（）是真正的复制酶。,F.真核生物线性染色体两端有端粒结构，它是由

17、许多成串的短重复序列组成，端粒功能是稳定染色体末段结构，防止染色体间的末端连接，并可补偿滞后链5-末段在消除RNA引物后造成的空缺，使染色体保持一定长度。端粒酶是含一段RNA的逆转录酶。,真核生物的DNA聚合酶,真核细胞DNA复制示意图,真核和原核DNA细胞复制比较,端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。,真核生物端粒和端粒酶,功 能, 维持染色体的稳定性 保证DNA复制的完整性,端粒的结构特点, 由末端单链DNA序列和蛋白质构成。 末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短 序列。,端粒酶（telomerase）,DNA复制需要引物，但在线

18、形DNA分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段。如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，实质上是一种逆转录酶，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。,端粒酶,端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT),端粒酶的组成和作

19、用,线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶的催化下，进行延长反应。,端粒酶的作用机制爬行模型,端粒酶的爬行模型（动画演示）,六 DNA复制的忠实性,DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制5109碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点:, DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，错配率为7 10-6 ）, DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3-5 外切酶切除）, 起始时以RNA作为引物,复制的保真性和碱基选择,DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 嘌呤的化学结构能

20、形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。,DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合酶活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现外切酶活性。,DNA聚合酶的校对功能,聚合酶,错配硷基,复制方向,正确核苷酸,5,5,5,3,3,3,切除错配核苷酸,起始时以RNA作为引物的作用,DNA复制为什么要合成一个RNA引物，而后又把这个引物消除呢？这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。已知DNA 聚合酶具有35外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前

21、一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA开始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。,一、DNA突变及意义 二、引起DNA突变的因素 三、 DNA突变的分子改变类型 四、 DNA损伤修复机制,第二节 DNA的损伤（突变）与修复,由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤，也称为突变（mutation）。 常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联、链的断裂、重组等。,一、DNA突变及意义,突变是进化、分化的分子基础 突

22、变导致基因型改变 突变导致死亡 突变是某些疾病的发病基础,（1）自发因素： 自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。 自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几百个核苷酸残基。 复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。,二、 引起突变的因素,由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中，X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。,（2）物理因素：,

23、嘧啶二聚体的形成,脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成H。,（3）化学因素：,烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。 DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。 碱基类似物：如5-FU、 6-巯基嘌呤（6-MP）等，可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。 断链剂：如过氧化物、含巯基化合物等，可引起DNA链的断裂。,三、突变的分子改变类型,DNA突变的类型,野生型基因,碱基对的置换(substitution),移码突变 (framesshift mutation)

24、,DNA分子上单一碱基的改变称点突变(point mutation),点突变(point mutation),镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基,正常成人Hb (HbA)亚基,血红蛋白-亚基的点突变,缺失 一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。,插入 原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。,框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,缺失或插入都可导致框移突变。,移码（框移）突变,缺失引起的框移突变,DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,重排(重组Recombination),DNA损伤修

25、复(repair) ：是对已发生分子改变的补偿措施，使其尽可能回复为原有的天然状态,光修复(light repair) 切除修复(excision repair) 重组修复(recombination repair) SOS修复(SOS repair),修复的主要类型：,四、 DNA损伤修复机制,这是一种广泛存在的修复作用，能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。 修复过程由光修复酶(photolyase)催化完成。,1）光修复（light repair）,其修复过程为： a.光修复酶(photolyase)识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物。 b.在300-600nm可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二

26、聚体的丁酰环打开。 c.光修复酶从DNA上解离。,DNA紫外线损伤的光裂合酶修复,1. 形成嘧啶二聚体,2. 光复合酶结合于 损伤部位,3. 酶被可见光激活,4. 修复后酶被释放,这也是一种广泛存在的修复机制，可适用于多种DNA损伤的修复。 切除修复机制的基本过程是将受损的DNA片段切除，然后再以对侧链为模板，重新合成新链进行修复。,2）切除修复(excision repair),DNA的损伤和切除修复,碱基丢失,碱基缺陷或错配,结构缺陷,切开,核酸内切酶,核酸外切酶,切除,DNA聚合酶,DNA连接酶,AP核酸内切酶,核酸外切酶,切开,切除,修复,连接,糖苷酶,插入酶,碱基 取代,DNA的重组

27、修复,胸腺嘧啶二聚体,复制,核酸酶及重组蛋白,修复复制,DNA聚合酶,DNA连接酶,重组,3）重组修复(recombination repair),这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。 修复时，利用重组蛋白的核酸酶活性，将另一股健康亲链与损伤缺口相互交换。,这是一种特殊的有差错修复机制,当DNA受到较大范围损伤,复制难以进行,细胞处于危机状态。此时,DNA复制短暂抑制,细胞可诱导产生新的缺乏校对功能的聚合酶,它能在DNA损伤部位进行复制而避免死亡,但变异率较高过程中所采用的方式。,4）SOS修复,第三节 逆转录和其它复制方式,一、概念和生物学意义,二、逆转录酶,三、病毒逆转录过

28、程,四、DNA的其它复制方式,一、概念与意义,以RNA为模板合成DNA，这与通常转录过程中遗传信息从DNA到RNA的方向相反，故称为逆转录作用。,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。 逆转录现象说明：扩充了中心法则,至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达的功能。 对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,DNA dependent DNA polymeraseDDDP DNA dependent RNA polymeraseDDRP RNA dependent RNA polymeraseRDRP RNA dependent DNA polymer

29、aseRDDP,DNA,复制（DDDP）,转录（DDRP）,翻译,RNA,复制（RDRP）,反转录（RDDP）,因发现逆转录病毒的遗传物质而获1975年诺贝尔奖的三位科学家,二、逆转录酶,三种功能,三 逆转录病毒细胞内的逆转录过程,逆逆转录病毒的生活周期,RNA,衣壳,被膜,逆转录酶,转录,转译,整合入宿主细胞染色体DNA,进入细胞,丢失被膜,丢失衣壳,逆转录,RNA,RNA,cDNA,衣壳蛋白,被膜蛋白,逆转录酶,滚环复制的过程,四、滚环复制和D环复制,滚环复制(rolling circle replication)：是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。,线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。,D环复制(D-loop replication),第四节 PCR(polymerase Chain reaction),聚合酶链式反应,PCR也称体外酶促基因扩增，原理类