实验一蛋白质变性凝固及沉淀(WT)

1、蛋白质的变性、凝固及沉淀,实验一,生物化学与分子生物学教研室,实验目的,能够说出蛋白质变性、凝固反应的原理及实验方法 能够说出蛋白质沉淀反应的原理及实验方法 能够运用盐析法及重金属沉淀法,主要实验内容,蛋白质的加热变性凝固 蛋白质沉淀反应 蛋白质盐析 重金属盐沉淀蛋白质 生物碱试剂沉淀蛋白质,蛋白质的变性 (denaturation),在某些理化因素的作用下，蛋白质严格的空间结构被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起若干理化性质和生物学性质改变的现象。,变性后的蛋白质称变性蛋白,能使蛋白质变性的物质叫蛋白质变性剂。,变性因素,物理因素,高温、高压,紫外线、X射线、,电离辐射和超声波等,化学因素,

2、强酸、强碱,有机溶剂、重金属盐,高浓度尿素、盐酸胍等,变性实质：,破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、 分子量不变）。,变性的可逆性,可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构可以恢复原状。 不可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构不能恢复原状。,蛋白质分子颗粒大小1-100nm之间,属胶体颗粒范围，在溶液中能形成稳定的胶体。,原因,蛋白质的胶体性质及沉淀:,表面形成水化层,表面同种电荷的斥力,除去这两个因素，就会发生沉淀。蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀。,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,-

3、,-,-,蛋白质胶体颗粒的沉淀,带正电荷的蛋白质,带负电荷的蛋白质,在等电点的蛋白质,酸,酸,碱,碱,脱水,脱水,脱水,不稳定的蛋白质颗粒 （沉淀）,带正电荷的蛋白质 （疏水胶体）,带负电荷的蛋白质 （疏水胶体）,碱,酸,（亲水胶体）,（亲水胶体）,（亲水胶体）,-,-,-,-,-,-,-,-,可逆沉淀,不可逆沉淀,结构和性质都不变,适当条件下可重新溶解,是分离和纯化的基本方法,结构和性质都发生变化,沉淀不再溶解于水,蛋白质的沉淀,蛋白质变性沉淀并凝聚成块状称为凝固。 不可逆变性状态,蛋白质的凝固,蛋白质变性、沉淀与凝固的关系,变性属于蛋白质本质的变化，沉淀和凝固属于一种现象 变性不一定沉淀，

4、变性蛋白质只在等电点附近才沉淀 变性蛋白易于沉淀， 沉淀蛋白不一定变性 沉淀的变性蛋白质也不一定凝固,蛋白质的加热变性凝固,蛋白质分子受热作用，分子空间结构变化，疏水基团暴露于分子表面，溶解度降低。 当蛋白质分子不带电荷（处于等电点条件下），则蛋白质发生聚集出现沉淀； 当蛋白质分子带电（处于非等电点条件下），则蛋白质因静电排斥作用而不出现沉淀；,实验内容,取三只小玻璃试管，各加入10%蛋白质溶液10d，分别标记为1、2和3号管； 向1号管中加入：pH4.8缓冲液10d 。混匀，于酒精灯上缓慢加热至沸点，观察变化（ ）；,高温下，蛋白质发生不可逆的变性并凝固。,向2号管中加入：H2O 8d, 0

5、.1mol/L HCl 2d。混匀，于酒精灯上缓慢加热至沸点，观察变化（ ） 停止加热，向2号管中逐滴加入：0.1mol/L NaCO3 。摇匀后继续滴加，一旦出现絮状物即停止。 将2号管于酒精灯上加热，观察现象（ ） 冷却后，再加入： 0.1mol/L HCl 2d。观察现象（ ）,蛋白质变性不一定出现沉淀； 蛋白质变性后在特定条件下发生沉淀； 沉淀加热后发生不可逆变性并凝固。,向3号管中加入：H2O 8d, 0.1mol/L NaOH 2d。混匀，于酒精灯上缓慢加热至沸点，观察变化（ ）； 停止加热，向3号管中逐滴加入：0.1mol/L HAC。一旦出现絮状物即停止。 继续滴加：0.1mo

6、l/L HAC 1d。观察现象（ ） 将3号管于酒精灯上加热，观察现象（ ） 向3号管中加入： 0.1mol/L NaOH 。一旦出现絮状物即停止。 将3号管于酒精灯上加热，观察现象（ ） 冷却后，再加入： 0.1mol/L NaOH 2d。观察现象（ ）,蛋白质变性不一定出现沉淀； 蛋白质变性后在特定条件下发生沉淀，并可逆；,蛋白质沉淀反应,蛋白质的盐析 一定浓度中性盐 （ (NH4)2SO4、Na2SO4等）可去除蛋白质分子所带电荷及其表面的水化层，从而使蛋白质从溶液中聚集沉淀出来。利用这个原理使蛋白质从溶液中沉淀出来的方法为盐析。 不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，可以通过不同浓度盐溶液

7、分离不同蛋白质，就是分段盐析。 大部分蛋白质都可用饱和(NH4)2SO4溶液盐析出来。 某些蛋白质在半饱和(NH4)2SO4溶液中析出。 盐析是一个可逆沉淀反应。,实验内容,取一只小玻璃试管，加入2mL蛋白质溶液； 加入等体积饱和(NH4)2SO4溶液，混匀后静置3min。观察现象（ ） 对该溶液进行过滤，将滤液收集于一只干净试管中，取部分转入另一只试管中； 向一只试管中加入结晶(NH4)2SO4粉末，直到粉末不再溶解（成为饱和(NH4)2SO4溶液）； 比较两只试管现象（ ）,蛋白质沉淀反应,重金属盐沉淀蛋白质 在碱性条件下，重金属离子与蛋白质结合成不溶性蛋白盐而沉淀。,实验内容,取一只小玻璃试管，加入1mL蛋白质溶液； 加入0.1mol/mL NaOH 2d，混匀； 逐滴加入CuSO4，摇匀，直至出现沉淀为止。,蛋白质沉淀反应,生物碱试剂沉淀蛋白质 在酸性条件下，蛋白质可与生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)结合成不溶性的盐沉淀，此时蛋白质带正电荷易于与酸根负离子结合成盐。,