环境中微生物的检测.ppt

1、第六章 环境中微生物的检测,微生物因为体积小、质量轻、适应性强等特点，在自然界中分布很广。但环境条件不同，微生物的种类和数量也不同。,第一节 土壤中的微生物,一、土壤是微生物生活的良好环境 土壤中的生态环境条件营养（有机质丰富）、水分（有一定含量）、空气（含氧气）、酸碱度（pH5.55.8，适宜）、渗透压（0.30.6MPa，等渗或低渗环境）、温度条件（较恒定）和表面保护层。 故土壤是微生物的大本营，也是人类最丰富的“菌种资源库”。,二、土壤中常见微生物类群 土壤中微生物的主要种类有： 细菌（占7090） 108 放线菌 107 丝状菌 106 酵母菌 105 藻类 104 原生动物 103,

2、三、土壤中微生物的数量与分布 不同类型的土壤中微生物的种类和数量是不相同的。调查结果表明，有机质含量丰富的黑土、草甸土、磷质石灰土等的微生物数量多；栗钙土、盐碱土、红壤土、砖红壤土的微生物数量较少。（见表1） 不同土层深度的土壤中微生物的数量和种类也不同。一般土壤表层微生物数量最多，随着土层的加深，微生物的数量逐步减少。,表1 我国各主要土壤的含菌量(万/克干土),土类 地点细菌放线菌真菌 暗棕壤 黑龙江呼玛2,32761213 棕壤 辽宁沈阳1,2843936 黄棕壤 江苏南京1,4062716 红壤 浙江杭州1,1031234 砖红壤 广东徐闻5073911 磷质石灰土 西沙群岛2,229

3、1,10515 黑土 黑龙江哈尔滨2,1111,02419 黑钙土 黑龙江安达1,0743192 棕钙土 宁夏宁武 140 11 4 草甸土 黑龙江亚沟7,8632923 嵝土 陕西武功9511,0324 白浆土 吉林皎河1,598553 滨海盐土 江苏连云港466410.4,1、取土样 选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约 2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取210cm处的土壤。 盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎 石、植物残根等。土样取回后应尽快投入实验，同时取10- 15g，称重后经105oC烘干8h，置于干燥器中冷却后再次称重， 计算含水量。,四

4、、土壤微生物的分离和计数,2、 倒平板 熔化已灭菌的上述4种培养基并冷却至45oC左右倒平 板，凝固待用，每种培养基每个稀释度各三只平板。,3、编号 取5支无菌空试管（15150mm）依次编号为10-3、10-4、 10-5、10-6、10-7。 4、分装无菌水 按无菌操作用5mL移液管分别吸取4.5mL无菌水于编号的 各无菌空试管中。,5. 制备土壤稀释液 称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻 璃珠的三角瓶中，振荡1020min，使土样中的菌体、芽孢 或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液。用无菌移液 管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三 次、摇匀

5、，此即为10-3浓度。同样方法，依次稀释到10- 7。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行，整个稀释 过程如图。,6、混菌法接种 细菌分离分别精确吸取10-7，10-6，10-5三个稀释度 的菌液1mL；放线菌分离分别吸取10-5，10-4，10-3三个稀 释度的菌液1mL；霉菌分离分别吸取10-4，10-3，10-2三个 稀释度的菌液1mL；酵母菌分离分别吸取10-6，10-5，10-4 三个稀释度的菌液1mL，对号加在已凝固的平板上，同时做 空白对照，空白对照只加培养基，不接种菌液。 7. 培养 将涂布后的平板上倒置于恒温箱中，细菌在37oC下培 养2448h，霉菌在28oC下培养35d

6、，放线菌在28oC下培 养57d，酵母菌30oC下培养23d,观察结果。,8. 计数 选菌落分散、菌落数适量且各平行皿菌落数接近的稀 释度的平皿计数，通常细菌和放线菌选取菌落数在30300 之间的平皿，霉菌选菌落数在10100之间的平皿，最后换 算成每克干土所含菌数。 同一稀释度的平均菌落数稀释倍数 每克干土含菌数 = 1土壤含水量,第二节 水体中的微生物,一、水体是微生物的天然生境 无论是海水还是淡水水体中，都有着微生物生长所必需的营养，有如土壤所具备的条件。,二、水体中微生物的数量和分布 1. 污染淡水 处于城镇等人口聚集地区的湖泊、河流等淡水。 108109个/mL水 主要是一些能分解各

7、种有机物的腐生菌，如芽孢杆菌、生孢梭菌、变形杆菌、大肠杆菌、粪链球菌等。有的甚至还含有伤寒、痢疾、霍乱、肝炎等人类病原菌。,2. 清洁淡水 （1）溪流及贫营养湖 10100个/mL水 以自养型种类为主。常见细菌有绿硫细菌、紫色细菌、蓝细菌、柄细菌、赭色纤发菌、球衣菌和萤光假单胞菌等。此外，还有许多藻类（如绿藻、硅藻等）、原生动物（如钟虫及其他固着型纤毛虫、变形虫、鞭毛虫等）和后生动物（如枝角类、桡足类等）。 （2）地下水、自流井、山泉及温泉 有机物和微生物都很少 石油岩石地下水含分解烃的细菌，含铁泉水有铁细菌，含硫温泉有硫磺细菌。,3. 影响微生物在淡水水体中分布的因素 水体类型、污染程度、有

8、机物的含量、溶解氧量、水温、pH及水深等。 4. 海水 除了一些从河水、雨水及污水等带来的临时种类外，绝大多数是耐盐、嗜冷、耐高渗透压和耐高静水压力的种类。海水中常见的微生物有假单胞菌属、弧菌属、黄色杆菌属、无色杆菌属及芽孢杆菌属等。一般在港口，每毫升海水含菌量为1105个，在外海每毫升含菌为10250个。,江、河、湖泊、池塘等水体中有机物含量比较多，微生物的种类数量也比较多。微生物在水体中表现为水平分布和垂直分布的规律。此外，相同水域的不同时期微生物的含量及分布也不同。,生活饮用水细菌卫生标准是：细菌总数100个/mL，大肠菌群值3个/L。,（一） 细菌总数测定,菌落总数需氧情况下，37培养

9、48h，能在普通营养琼脂平板 上生长的细菌菌落总数.,作用：判定食品被细菌污染的程度及卫生质量的优劣，对被检样品 做出适当的卫生学评价。,基本操作一般包括： 样品的稀释倾注平皿培养48小时计数报告。,三、水的细菌学检测,1、样品的处理和稀释,操作要求：“无菌操作”贯彻始终。,减少误差：每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管，将吸管内液体沿管壁流入， 勿使吸管尖端伸入稀释液内，并且稀释液应充分振摇。,环境要求：琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。,代表性：取固体样品时需多采几个部位，且经过均质或研磨； 液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。,2、稀释样品的取样和倾注平皿,每

10、个稀释度 做两个平皿,将凉至46营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。,1.取样,倾注平皿,1：10稀释液 225mL无菌水,1mL,1mL,9mL稀释液 1：100,9mL稀释液 1：1000,1mL,1mL,1mL,1mL,1mL,1mL,1mL,1ml无菌水,25g或25ml 检样,3、培养及计数,培养条件：倒置于361温箱内培养482h,计数时间：到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放 置于04，但不得超过24h。,菌落总数报告方式,计平皿中菌落数：肉眼观察，必要时用放大镜检查。记下各平板的菌落总数，求出同稀 释度的各平板平均菌落数。,规律：不同稀

11、释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落 数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈 多。 如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现 象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。,当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。,当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片

12、状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。,菌落总数报告方式,计数原则：选平均菌落数在30300之间者进行计算,2.若有2个稀释度的平均菌落数在30300之间时，则按两者的菌落总数之比来决 定，若比值小于2应报告两者的平均数；若大于2则报告其中较小的菌落总数。,3.若所有稀释度的平均菌落数均大于300，以稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍 数报告之。,4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀 释倍数报告之。,5.若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则以最接近300或30的平均菌 落数乘以稀释倍数报告之。,6.

13、若所有的菌落数匀为“无法计数”时，应注明水样的最大稀释倍数。,7.在求同稀释度的平均数时，若其中1个平板上有较大片状菌落生长时，则不宜 采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落约 为平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均匀，则可按半平板上的菌落计数， 然后乘以2作为整个平板的菌落数。,1.仅1个稀释度的平均菌落数在此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数报 告之。,报告原则,菌落总数报告方式,4、菌落总数报告方式,菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。为了缩短数字后面的零位，

14、可用10的指数来表示。,固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（mL）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。,作业：,对某一自选食品进行微生物学检验设计。 要点：1.食品相关记录（名称、厂家、商店等） 2.所用物品起清单（设备及易耗品等） 3.工作计划（人员安排、进度计划等） 4.报告格式（表格设计及报告高书等）,(二) 大肠菌群测定 国家标准采用三步法,1、检验查表方法,大肠菌群 需氧及兼性厌氧、在37能分解乳糖产酸产气的革 兰氏阴性无芽胞杆菌。,较清洁样品的三步法图示,三步法图示,大肠菌群测定,2、计算方法,挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落； 红色、粉红色菌落。,抑

15、制剂：胆盐、煌绿、十二烷基硫酸钠。,产酸判断：紫色培养液变成黄色,产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试管有气泡沿管壁 上浮，应考虑可能有气体产生，需进一步试验。,美国FDA标准方法,行业标准采用两步法：,用于对出口食品中大肠菌群进行检验,练习：,如对一自来水厂出水进行检验，初发酵一般在10支小发酵管和两支大发酵瓶内进行，复发酵在5支小发酵管内进行。以300mL进行初发酵实验，其中100mL的水样2份（分状于2个大发酵瓶中），10mL水样10份，（分状于10支个小发酵管中）。实验结果：100mL的2份水样为阴性结果，无大肠杆菌存在；10mL的水样中有5份为阳性结果，存在大肠杆菌。则： MP

16、N=?,第三节 空气中的微生物,空气的生态条件不适合微生物生长繁殖。（营养不足、紫外线照射、水分少）。,一、空气微生物的来源 空气中的微生物主要来自土壤飞起来的灰尘、水面吹起的水滴、生物体体表脱落的物质、人和动物的排泄物等。,二、空气中微生物的数量和分布 空气中的微生物大部分是腐生的种类，但是不同的空气环境中微生物的种类不同。有些种类是普遍存在的，如某些霉菌、酵母菌、真菌孢子。细菌主要是来自于土壤的腐生性种类，常见的为各种球菌、芽孢杆菌、产色素细菌等。 空气中微生物的分布随环境条件及微生物的抵抗力不同而呈现不同的分布规律。空气中微生物的数目决定于尘埃的总量。空气中尘埃含量越高，微生物的种类数量越多。,表4-2 不同条件下1m3空气的含菌量,三、空气微生物的卫生标准 室内空气污染的指标：5001000个/m3。,四、空气中微生物的检测方法,常用的检验方法是沉