实验六__过氧化氢酶米氏常数(Km)的

1、实验七 过氧化氢酶米氏常数（km）的测定,一、实验目的,学习米氏常数（km）的测定方法。,二、实验原理,过氧化氢酶(cat)催化下列反应： 2h2o22h2o+o2 h2o2浓度可用kmno4在硫酸存在下滴定测知。 2kmno45h2o23h2so4 2mnso4k2so45o28h2o 求出反应前后h2o2的浓度差即为反应速度。双倒数作图法求出过氧化氢酶的米氏常数。,米氏常数的测定：双倒数作图法（lineweaver-burk法）,1 km 1 1 = . + v vmax s vmax,三、试剂,10.05mol/l草酸钠标准液 将草酸钠（ar）于100105烘12h。冷却后，准确称取0.

2、67g，用水溶解倒入100ml量瓶中，加入浓h2so4 5ml，加蒸馏水至刻度，充分混匀，此液可贮存数周。 2约0.02ml kmno4储存液 称取kmno4 3.4g，溶于1000ml蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保存。,30.004mol/l kmno4应用液 取0.05mol/l草酸钠标准液20ml，于锥形瓶中，加浓h2so4 ml，于70水浴中用kmno4贮存液滴定至微红色，根据滴定结果算出kmno4贮存液的标准浓度，稀释成0.004mol/l，每次稀释都必须重新标定储存液。 4约0.05mol/l h2o

3、2液 取20%h2o2（ar）40ml于1000.0ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，临用时用0.004mol/l kmno4标定之，稀释至所需浓度。 50.2mol/l磷酸盐缓冲液（ph7.0）。,四、操作步骤,l血液稀释 吸取新鲜（或肝素抗凝）血液0.1ml，用磷酸盐缓冲液(ph7.0，0.2mol/l)稀释至150ml，得1：1500稀释血液。 2h2o2浓度的标定：取洁净锥形瓶两只，各加浓度约为0.05mol/l的h2o2 2.0ml和25%h2so4 2.0ml，分别用0.004mol/l kmno4滴定至微红色。从滴定用去kmno4ml数，求出h2o2的mol浓度。,3反应速度的测定：取

4、干燥洁净50ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。,依次加入1：1500稀释血液每瓶0.5ml，边加边摇，反应时间5min，按顺序向各瓶加25%h2so4 2.0ml，边加边摇，使酶促反应立即终止。 最后用0.004mol/l kmno4滴定各瓶至微红色，记录kmno4消耗量(ml)。,五、计算,1.反应速度的计算：以反应消耗的h2o2 mmol数表示。 反应速度=加入的h2o2 mmol数剩余的h2o2 mmol数 即：h2o2 mol浓度加入的毫升数kmno4 0.004 mol/l消耗的kmno4毫升数 5/2 （式中：5/2为kmno4与h2o2反应中mol换算系数）,2求km值： 下面引用一次实验结果为例，求过氧化氢酶的km值，供计算参考。 己知kmno4为0.004mo1/l，标定出h2o2浓度为0.05mol/l，列表计算如下：