实验八：NADH正、负向反应测定酶的活性 - 副本

1、实验五,nadh正、负向反应测定酶的活性,一、nadh正向反应法测定血清ld(连续监测法),目的： 1通过对ld的测定，要求掌握nadh正向反应法测定的基本原理，以及该法测定应注意的事项； 2熟悉ld测定原理和注意事项及方法学评价；了解利用nadh正向反应法测定其它项目的基本原理。,原理,ld催化下述反应： l一乳酸+nad+ ld 丙酮酸+nadh+h+ 在反应过程中，乳酸氧化生成丙酮酸，同时使nad+还原为nadh。nadh在340nm处有吸收峰，因此反应会引起340nm吸光度的增高，并且吸光度增加的速率与样本中ld的酶活性成正比。,试剂,1 tris一乳酸锂缓冲液(含tris 100mm

2、ol/l，乳酸锂55mmoll) : 2底物应用液(含tris 100mmoll，nad8.5mmoll),操作步骤,1标本要求：血清或肝素抗凝血浆 2主要参数： 孵育时间：120s 连续检测时间：120s 温度：37,5min,s:4l r1:200l,r2:50l,340/405nm,结果计算,式中 amin：平均每分钟吸光度增加值 6220：340nm处nadh的摩尔吸光系数 v(1.05)：比色液总体积(m1) v(0.05)： 血清用量(m1) l:1cm比色光径。 参考范围:成人109245 ul。,注意事项,1ld活性测定也可用抗凝血浆，但不同抗凝剂对ld测定的影响不同：草酸盐抗

3、凝剂、edta能抑制ld活性，而肝素的影响不大。 2不同的ld同工酶对温度的敏感性是不同的，组织提取液若放于一20过夜，ld4和ld5会丧失全部的活性。血清标本应存放于室温下，一般23天不会出现活性的丢失。如果血清标本需要存放较长时间，应加入10mgml的nad+或31/ml的谷胱甘肽后于4保存。 3ld活性能被巯基试剂所抑制，另外硼酸、丙二酸、草酸以及edta都是竞争性抑制剂。 4由于红细胞、血小板中含有大量的ld，故严禁使用溶血标本。在采用血浆作为标本时必须用3000rmin离心15min以除去血小板。,方法学评价,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，ld)是糖酵解和糖

4、异生中的一个重要酶，含有锌离子，广泛分布于人和动物组织、植物和微生物中，能可逆地催化乳酸(l)和丙酮酸(p)之间的氧化还原反应。 其中lp为正向反应，pl为逆向反应。正反两向 反应的最适ph不同，其中正向反应最适ph为8.89.8，偏碱，能使平衡偏向生成丙酮酸的方向。其优点是乳酸和nad+稳定性好，且nad+纯品易得、价格较低，过量乳酸对ld活性的抑制较小，反应线性较好。 缺点是需要较高的底物浓度，反应速度较慢。 ld活性测定时正向反应和逆向反应都可以运用，但1996年中华医学会检验学会酶学组专家推荐选择正向反应,方法学评价,本实验是根据正向反应(lp)建立的连续监测法，其优点在于： 乳酸盐与

5、nad+底物溶液的稳定性较好，冰冻放置可稳定6个月以上。且两溶液的浓度对测定方法的影响最小，nad+较少被产物抑制。 反应的线性范围较宽(726u/l)，重复性较好，精密度较高(ld为65u/l时日间cv为5.8，ld为149u/l时日间cv为3.2) 特异性高(血清中存在的非ld的其他nad+类氧化还原酶的内源性底物少，加上样本被高度稀释，故这些酶的干扰作用可忽略不计)。,思考题,1nadh正向反应法测定的基本原理是什么?请列举出应用nadh正向反应法测定其他生化检验项目的原理? 2ld的测定为什么推荐采用l p正向反应法?该反应存在哪些缺点? 3ld的测定的血清标本，在处理和保存中应注意哪

6、些事项?,二、nadh负向反应法测定血清alt(连续监测法),目的: 通过对alt测定，要求掌握nadh负向反应法测定的基本原理，以及该法测定应注意的事项； 掌握单、双试剂测定alt的原理和方法；熟悉alt连续监测法测定的优缺点和方法学评价； 了解利用nadh负向反应法测定其他项目的基本原理。,原理,l-丙氨酸+-酮戊二酸 alt -丙酮酸 + l-谷氨酸 -丙酮酸+nadh ldh 乳酸+nad+ 连续监测法测定nadh被氧化为nad+可在340nm连续监测到nadh的消耗量，从而计算出alt活性浓度alt双试剂法测定中，首先使血清与缺少-酮戊二酸的、底物溶液混合，37保温5min，将样品中

7、所含的-酮酸(如丙酮酸)消 耗完，然后，加入-酮戊二酸启动alt催化的反应，在波长340nm处连续监测吸光度下降速率。根据线性反应期吸光度下降速率(-a/min)，来计算alt的活性浓度。,操作步骤,1标本要求：血清或肝素抗凝血浆 2主要参数： 孵育时间：90s 连续检测时间：150s 温度：37,5min,s:20l r1:200l,r2:50l,340/405nm,结果计算,式中6220为nadh在340nm的摩尔吸光系数。 参考范围540ul。,注意事项,1使用连续监测法测定酶的活性时，要求使用的分光光度计， 比色杯光径1.0cm，具有 (370.1)的恒温装置。由于试剂空白的读数来自工

8、具酶中的杂酶及nadh自发氧化。在报告结果时应扣除每批试剂的空白测定值。 2血清不宜反复冰冻保存，以免影响酶活性。血清置4冰箱1 周，酶活性无显著变化，不推荐冰冻保存alt测定标本，而宜用新鲜血清标本。草酸盐、肝素、枸橼酸盐虽不抑制酶活性，但可引起反应液轻度混浊。血液混浊时可影响测定结果或无法测定(如血脂过高、血清蛋白变质等)。红细胞内alt含量为血清中35倍，应避免 使用溶血标本。 3正常新生儿alt水平比成年人约高2倍，出生后约3个月降至成人水平。,方法学评价,1alt测定中存在着两个副反应 (1)血清中存在的-酮酸(如丙酮酸)能消耗nadh。 丙酮酸+nadh ldh 乳酸+nad+ (

9、2)血清中谷氨酸脱氢酶(gldh)增高时，在有氨存在条件下，亦能消耗nadh. nh4+-酮戊二酸+nadh gldh 谷氨酸+nad+co2 上述副反应都能消耗nadh,使340nm处吸光度下降值(-amin)增加，使测定结果偏高。但在双试剂法，因温育期长，能有效地消除干扰反应，测定准确性高，因而是alt测定的首选方法。双试剂法还可适当降低试剂中的ld的用量。至于nh4+的干扰，除严重肝病时血清谷氨酸脱氢酶活性增高和血氨增高外，一般血清中nh4+的含量甚微，此干扰反应不大。,方法学评价,2在aacc(美国临床化学学会)或ifcc(国际临床化 学学会)推荐的试剂盒中，含有磷酸吡哆醛(p一5一

10、p)，在某些病理状态下，血清中存在脱辅基的alt酶蛋白，当使用含p一5一p的底物时可使血清alt活性提高755。变化的大小与血清中原有p一5一p含量有关，健康人血清中p一5一p水平偏低，底物中p一5一p可显著升高alt活性。 根据我国的实际情况和习惯,国家卫生部临床检验中心的推荐方法试剂中不加p一5一p。,方法学评价,3在alt测定中，有的用磷酸盐缓冲液，有的用tris缓冲液，有文献报告：nadh在tris缓冲液中稳定性较高；p-5-p在tris缓冲液中却能显示更有效的激活作用； 4本法由于测定上限在酶促反应的线性范围内，偏差小，准确性好；测定条件较赖氏法易于控制，cv值比赖氏法小，精确性好；标本测定中不需要标准对照，测定结果计算方便，操作简便。但实验条件要求严格，成本高。,思考题,1nadh负向反应法测定的基本原理是什么?请列举出应用nadh负向反应法测定其他