琼脂糖凝胶电泳试验课件.ppt

1、琼脂糖凝胶电泳技术，实验3，实验1，实验目的学习和掌握DNA电泳的技术方法，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度、含量和分子量，分离不同大小的DNA片段。材料、试剂和仪器材料：质粒、银杏DNA试剂：DL2000 Marker、琼脂糖、50TAE电泳缓冲液、6加载缓冲液、EB储存液、双蒸馏水仪：电泳仪、微波炉、成像系统、电子天平、移液管、一次性薄膜手套、量筒、烧杯、三角瓶、吸头等。第三，实验原理，简而言之：DNA分子带负电，在电场中通过电荷效应和分子筛效应向正电极移动的过程中，由于DNA分子大小和构象的不同，迁移位置也不同。对于线性的脱氧核糖核酸分子，电场中的迁移率与其分子量的对数成反比。在电泳过

2、程中加入溴化乙锭，溴化乙锭与脱氧核糖核酸结合形成荧光复合物，在254365纳米的紫外线照射下能产生橙红色荧光。(用这种方法可以观察到凝胶中的脱氧核糖核酸。)。琼脂糖可制成不同孔径的凝胶，分离范围广，约200-50kb。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。当它被加热到沸点，然后冷却和固化，它将形成一个良好的电泳介质，其孔径大小取决于其浓度。电泳介质中的孔径对电泳迁移中的带电分子产生阻力，这取决于带电分子的大小和物理性质。在生理条件下，核苷酸的磷酸基团带负电荷，所以脱氧核糖核酸分子是聚阴离子，在电场中迁移到正电极。脱氧核糖核酸分子的电荷与其大小成正比。在一定的电场强度下，大的脱氧核糖核酸分子比小的脱氧核糖

3、核酸分子跑得快，没有任何介质阻碍迁移。然而，在实际的电泳中，由于使用琼脂糖分子筛介质，它对大分子DNA有很强的抵抗力，因此大分子DNA尽管电荷高，但很难快速前进；由于小分子DNA可以通过介质的网孔，其带电量相对较小，但仍能快速迁移到正极。因此，不同的脱氧核糖核酸分子在琼脂糖凝胶中具有不同的迁移距离，这种迁移距离的差异使得不同大小的脱氧核糖核酸能够被分离。影响核酸迁移率的因素：影响核酸电泳的因素1)核酸的性质核酸的电荷量、分子大小和分子空间构象决定了不同的核酸分子具有不同的迁移率。线性双链DNA分子，分子量的普通对数与迁移速率成反比；然而，分子的空间构象影响迁移速率。例如，具有相同分子量的质粒D

4、NA的迁移速率是闭环线性单链开环类型。其他结构如：(1)单链核糖核酸或单链脱氧核糖核酸的分子内局部配对；(2)凝胶孔径琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是核酸凝胶电泳常用的支持材料。形成的凝胶的分子筛网孔大小可以通过改变两种支持介质的浓度来调节，并且可以分离不同分子量的核酸片段。不同(空间)类型核酸的凝胶电泳：单链核糖核酸或单链脱氧核糖核酸变性剂的凝胶电泳：在缓冲液和凝胶中加入尿素或甲醛等核酸变性剂，打开分子内配对结构，使其电荷与分子形状无关，只与分子大小有关。质粒(具有高级结构的DNA)的通用琼脂凝胶电泳；但是，由于结构不同，可能会出现不同的条带。大分子脉冲电泳和蛋白质结合的DNA复合物的电子

5、迁移率分析。3)当电场强度和方向较低时，线性DNA片段的电泳迁移率与外加电压成正比，凝胶电泳的电场强度通常不超过5V/cm凝胶。对于大分子量真核生物基因组DNA片段的电泳，0.51.0伏/厘米的电泳经常使用过夜，以获得更好的分辨率和整洁的条带模式。可以分离出非常大的脱氧核糖核酸片段传统上，TAE是最常用的，但它的缓冲能力很低。长期电泳需要正负电极池之间的缓冲液循环，TAE应经常更新。缓冲溶液的离子强度与样品迁移速度成反比，电泳的最佳离子强度一般在0.020.2之间。在高离子强度下(如误加10个电泳缓冲液)，溶液的电导率极高，并明显发热，这可能导致凝胶融化和DNA变性。缓冲液的酸碱度影响脱氧核糖

6、核酸的流动性。当溶液的酸碱度远离样品的等电点时，样品电荷越多，迁移越快。在核酸电泳溶液中经常使用碱性或中性条件，这使得核酸带负电并向正电极迁移。在电泳过程中，荧光染料EB可以插入到碱基中，从而增加了线性和开环DNA的长度，使其更加坚硬，并使线性DNA的迁移率降低了15%。此外，温度和碱基堆积也会影响脱氧核糖核酸的流动性。1.基因组DNA和质粒pGEX-4-T的浓度和纯度用埃本多夫生物光度计测定。1)给定的脱氧核糖核酸样品分别用无菌蒸馏水稀释2倍和10倍，编号为脱氧核糖核酸1、脱氧核糖核酸2、前列腺素1和前列腺素2；2)将用无菌蒸馏水清洗过的比色杯倒置在吸水纸上晾干，用移液管将约1毫升无菌水吸入

7、比色杯中作为空白对照；3)以无菌蒸馏水为空白调试核酸浓度测试仪，分别测量各稀释样品的浓度和纯度，并记录所得数据；每个样品测量3次。4)根据稀释倍数计算原始样品的浓度。1)取50TAE缓冲母液(多少？2)加入蒸馏水制备1TAE电泳缓冲液；2)称量琼脂糖(多少克？)，转移到三角瓶中，在微波炉中加入TAE缓冲溶液熔化；3)装上凝胶板，插入梳子，放在水平台上，注意梳子底部与凝胶板表面的距离为0.51毫米；4)待胶水冷却至6070后，加入EB，直至最终浓度为0.5g/ml，倒入一个约35mm厚的密封凝胶罐中。注意检查是否产生气泡。如果有的话，用吸管小心地吸出气泡。(4)实验过程；(5)凝胶冷却固化后，小心地取出梳子和挡板，将其放入水平电泳槽中，缓冲液将使凝胶浸没12毫米。6)取样：向样品中加入1/5体积的6加载缓冲液，混合均匀，向凝胶取样孔中加入1015升，并加入56升Dl 2000马克作为脱氧核糖核酸分子量标准，以估计脱氧核糖核酸样品的大小。7)电泳：连接电泳仪的导线，注意正负电极的位置；恒压电泳。电压为10V/cm，当电泳达到采样孔到凝胶板的2/3距离时，电源关闭。8)取出凝胶块，放在紫外透射仪或成像系统上观察，可以看到橙红色或白色