分光光度法测定甲醛含量的研究

1、第 4卷第 6期 2008年 12月 南 ? 方 ? 水 ? 产 South China Fisheries Science Vol ?4,No ?6 Dec ?,2008 收稿日期:2008?06?27 ; 修回日期:2008?09?04 资助项目: 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(中国水产科学研究院南海水产研究所 ) 资助项目( 2008TS04 ;2007TS11) 作者简介: 马海霞( 1977- ), 女, 硕士, 助理研究员, 从事水产品质量安全和水产品综合利用研究。 E?ma i:lhaix ia928 yahoo?com? cn 分光光度法测定水产品中甲醛含量的研究

2、 马海霞, 李来好, 杨贤庆, 吴燕燕, 周婉君, 刁石强, 陈胜军 (中国水产科学研究院南海水产研究所, 广东 广州 510300) 摘要: 研究采用乙酰丙酮分光光度法测定水产品中的甲醛含量, 对样品的前处理过程进行了比较系统的探讨, 确定了比色测定参数, 并对其用于快速测定水产品中甲醛含量的可行性进行了讨论。实验结果表明, 用冰浴浸 泡法前处理样品时, 最佳浸泡时间为 10m in, 样液 p H 值用 100 g ?L- 1氢氧化钾溶液调至 6; 沸水浴中最佳显色时 间为 3m in, 比色波长为 412 nm; 当甲醛含量在 0 2?5 ?g ?mL- 1范围内时, 该方法具有很好的线

3、性关系 (R 2 = 0?9998); 与蒸馏法前处理样品相比,该方法的加标回收率比 较高, 在 89?50% 94?25% 之间,而前者为 64?17% 76?92% ; 该方法的 RSD (% ) 为 2?93% , 样品的最低检出浓度为 0?9mg ? kg- 1。 关键词: 甲醛; 乙酰丙酮; 分光光度法; 水产品 中图分类号:TS207?5? ? ? ? 文献标识码:A文章编号:1673- 2227-( 2008) 06- 0026- 07 Spectrophotometric determination of for maldehyde in aquatic products MA

4、 Haixia ,LI Laihao,YANG Xianqing, WU Yanyan , ZHOU W anjun ,DI AO Shiqiang,CHEN Shengjun (South China SeaFisheries Research Institute, ChineseA cademy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China) Abstract : For maldehyde in aquatic productswas deter mined by acetyle acetone spectrophoto metry in th

5、e present research? The colori? metric para meters and the preprocessing of sa mples in the methodwere studied ,and the feasibility of using acetyle acetone spectropho? to metry as amethod in rapid deter mination of for maldehyde in aquatic productswas discussed aswell ? Results showed that the opti

6、 mal soaking ti me was 10m in during ice incubation,then soaking solution p H value was adjusted to 6 w ith 100 g ? L- 1KOH solution,and the opti mal colori metric ti me was 3 min at a wave length of 412 nm? The linear relation between absorbency and for maldehyde dosage was very good (R2= 0?9998) w

7、hile the formaldehyde content variedw ithin a range of0 2?5 ?g ?mL- 1? The recovery of the present method was 89?50 % 94?25 % , while the recovery of the distillationmethodwas only 64?17 % 76?92% ? Co mparing with the latter method,the recovery ofpresentmethodwasmuch better ?RSD (% ) of the presentm

8、ethodwas2?93% , and themini mum detectability of for maldehyde in sampleswas 0?9mg ?kg- 1? K ey words :for maldehyde ;acetyle acetone ;spectrophoto metry ;aquatic product ? 第 6期 ? 马海霞等: 分光光度法测定水产品中甲醛含量的研究 ? 27? ? ? ? 甲醛 ( CH2O,for maldehyde) 又称蚁醛、亚甲 基氧化物,是一种具有强还原性的原生质毒素。甲 醛进入人体器官后,对人的神经系统、肺和肝脏均 有损害,

9、 长期接触低剂量甲醛可引起慢性呼吸道疾 病、鼻咽癌、结肠癌和脑瘤等, 国家明令规定在食 品中禁止使用甲醛。然而, 由于用甲醛浸泡水产品 和水发食品可提高产品的感官质量和延长保质期, 近年来一些不法商贩为了获得较高利润,在水产品 中人为添加甲醛, 严重危害到消费者的食用安全和 身体健康。 在食品分析中, 分光光度法因具有操作简便、 快速、灵敏度高和重复性好等优点而被较多的应 用。对于水产品中甲醛含量的测定,主要的分光光 度比色分析法有间苯三酚法 1、变色酸法 ( CTA 法 ) 和乙酰丙酮法 2, 其中乙酰丙酮法是测定甲 醛较为理想的分析方法。用乙酰丙酮法测定食品中 甲醛含量时, 一般采用蒸馏法

10、前处理样品, 样品中 的甲醛先在磷酸介质中加热蒸馏出来, 再与显色液 反应,然后比色测定, 食品成分、磷酸用量和浓度 等对甲醛测定存在较大影响 3。文章采用乙酰丙 酮法对水产品中的甲醛进行定量分析, 与蒸馏法相 比, 改进和简化了样品前处理条件,并对样品的前 处理条件、比色测定参数和检测限进行了研究, 比 较了此方法和蒸馏法前处理样品的回收率和精密 度, 同时对方法的可行性进行了分析。 1? 材料与方法 1?1? 材料 仪器。 SPECTRONIC GENESYS 5紫外分光光 度计,DS? 1高速组织捣碎机,电子天平,SIGMA? 3K30冷冻离心机, 雷磁 pHS? 25 pH 计。 试剂

11、:( 1) 甲醛标准溶液。吸取 0?3 mL 含量 为 37?0 % 40?0 % 甲醛溶液于 100 mL 容量瓶中, 用水定容,混匀,为甲醛储备溶液,冷藏保存 (此溶液可保存 1个月 ); 用碘量法标定,临用时 取适量稀释至 5 ?g ?mL - 1; ( 2) 乙酰丙酮溶液。称 取乙酸铵 25?0 g, 溶于 100 mL水中,加冰乙酸 3 mL和乙酰丙酮 0?4mL,混匀, 贮存于棕色瓶 (此 溶液置于冰箱冷藏可保存 1个月 );( 3) 100 g ?L - 1 三氯乙酸溶液。称取固体三氯乙酸 100?0 g溶于水 中,稀释至 1 000mL;( 4) 100 g ?L - 1氢氧化

12、钾溶 液。称取固体氢氧化钾 100?0 g溶于水中,稀释至 1 000mL。所用试剂均为分析纯,实验用水为蒸馏 水。 样品。冰鲜龙头鱼(Harpadon nehereus)、冰 鲜花斑蛇鲻( Saurida undosquam is) 和鲜活罗非鱼 (T ilapia mossambica) 等水产品,均购于广州市海 珠区大江苑市场。 1?2? 方法原理 甲醛与乙酰丙酮及氨作用,生成黄色的 3 5? 二乙 酰基?1 4 二氢卢 剔啶( 3 5?diacetyl? 1 4?di? hydrolutidine) 4, 根据有色物质颜色的深浅,用分 光光度计在 412 nm 处比色定量。其化学反应式

13、如 下: 1?3? 样品处理 取水产品肌肉等可食部分,取样量不应少于 100 g ,样品切为小块, 用高速组织捣碎机充分捣 碎混匀。称取捣碎混匀的样品 5?00 g置于 150 mL 具塞三角瓶中,按原料质量与水体积比为 1? 10 (W /V) 加水于三角瓶中, 塞上瓶塞,振摇使其混 合均匀,立即在冰浴中 (防止甲醛挥发 ) 放置 10 m in ,加入 100 g?L - 1三氯乙酸 10 mL, 混匀,于 4 、 4 000 r ?m in - 1离心 5 m in, 过滤,用 100 g? L - 1氢氧化钾溶液调滤液 p H 值于 6左右, 将滤液 移入 100mL容量瓶中,定容。同

14、时做空白试验。 ? 28? ? ? ? 南? 方? 水? 产 ? 第 4卷 1?4? 样品检测 1?4?1? 绘制甲醛标准曲线 ? 分别吸取 5 ?g? mL - 1 甲 醛 标 准 溶 液 0?00 、 0?20 、 0?50 、 1?00、 2?00 、3?00 、4?00和 5?00 mL 于 10 mL 纳氏比色 管中,加水至刻度,接着加入 1mL乙酰丙酮溶液, 混合均匀,然后在沸水浴中显色 3 m in (注:试样 放入沸水浴后,水需在 20 s内复沸腾 ), 取出用自 来水冷却至室温。以空白为参比, 于波长 412 nm 处, 以 1 c m 比色杯进行比色, 测定吸光度, 以吸

15、光度值为纵坐标, 甲醛含量为横坐标, 绘制标准曲 线。 1?4?2? 样品测定取处理好的样品浸泡液 10 mL于 10 mL纳氏比色管中 (如果甲醛含量太高可 以稀释 ), 加入乙酰丙酮溶液 1mL, 混合均匀。显 色方法和比色步骤同 1?4?1 。记录吸光度值,查标 准曲线计算甲醛含量。 1?4?3? 计算样品中甲醛含量按下式计算: X = A !v m 式中 X 为样品中甲醛含量,单位为毫克每千 克(mg? kg - 1 );A 为样品管中甲醛含量( ?g? mL - 1 );v为样品浸泡液总体积(mL); m 为样品 质量 ( g)。 2? 结果与分析 2?1? 最大吸收波长的选择及其线

16、性关系 经甲醛标准溶液显色后的吸收波长光谱扫描实 验, 发现该溶液在波长 412 nm 处有最大吸收峰 (图 1), 这与吴鑫德和刘勋钢 5报道的结果吻合。 2?2? 显色时间的确定 甲醛标准曲线见图 2 。甲醛含量在 0 2?5 ?g ? mL - 1范围内, 此方法具有很好的线性关系。 甲醛溶液浓度分别为 1 、 2和 3 ?g?mL - 1时, 其与乙酰丙酮在沸水浴中的显色时间与吸光度的关 系见图 3- a c 。甲醛与乙酰丙酮在沸水浴中反应 生成显色产物的速度很快,在显色 2 3 m in内, 各浓度甲醛溶液中显色产物 3 5? 二乙酰基 ? 1 4二 氢卢剔啶的吸光度值均达到最大值,

17、即表示显色已 完全, 实验表明室温下此显色液的吸光度值在 10 h 内基本不变;随着在沸水浴中显色时间的延长,各 浓度甲醛溶液中显色产物的吸光度值均有不同程度 的下降,但下降幅度较小, 吸光度值的变化范围均 在 0?00 0?030以内,因此, 基本上可看作是稳定 的。实验选择 3 m in作为沸水浴中的显色时间。 2?3? 样液 pH值对吸光度值的影响 像龙头鱼、罗非鱼、蛇鲻等白色肌肉的鱼浸泡 液若不使用蛋白质沉淀剂而直接离心、过滤, 则滤 液略显乳白色, 而且在沸水浴中显色后, 会产生细 小的白色颗粒或絮状沉淀, 影响比色结果。由于三 ? 第 6期 ? 马海霞等: 分光光度法测定水产品中甲

18、醛含量的研究 ? 29? ? ? 图 3? 甲醛? 乙酰丙酮溶液沸水浴中显色时间与吸光度的关系 F ig?3? Relationships between reaction ti me of for maldehyde?acetyle acetone solution in boiling water incubation and absorbency 氯乙酸既可作为蛋白质沉淀剂, 又可作为甲醛萃取 剂 6, 所以采用三氯乙酸作为蛋白质沉淀剂。但 三氯乙酸的酸性比较强,能明显改变样品浸泡液的 p H 值,从而对比色结果会造成一定影响,因此, 需加入碱性物质使样品浸泡液 p H 值满足显色要 求

19、。此实验采用 100 g?L - 1的氢氧化钾调节相同质 量的同一海水鱼浸泡液 pH 值分别为 1?2 、 1?3、 1?45 、3 、 4 、 5 、 6 、 7和 8 ,比色测定,记录吸光 度值。每一 p H 值做 3个重复,各吸光度值取其平 均值,结果见图 4 。 在样品前处理过程中, 当加入 100 g ?L - 1三氯 乙酸 10 mL 时,样品浸泡液的 pH 值降至 1?3左 右, 所测得的吸光度值偏小;调节样液 p H 值至 6?0时,吸光度值达到最大值。当样品浸泡液的 p H 值调节至 3 8之间时, 每 10mL样液中分别加 入 1mL乙酰丙酮液后,混合液的 p H 值均在

20、5?4 5?5之间,各样液吸光度值的变化幅度比较小; 采 用蒸馏法前处理样品, 样品蒸馏液的 p H 值呈弱酸 性, 一般不需要调节 p H 值。在此方法中,由于三 图 4? 样品浸泡液 pH值对吸光度的影响 Fig ?4?Effects of soaking solution p H value on the absorbency of reaction solution 氯乙酸的酸性比较强, 样液不调节 pH 值所测得的 吸光度值会偏小致使结果偏低, 所以样品前处理过 程中将样液 p H 值用 100 g ?L - 1氢氧化钾调至 6 , 使 之介于吸光度值的变化幅度较小的范围之内。 2?

21、4? 显色剂用量的确定 当样品中甲醛含量太高时, 显色剂乙酰丙酮用 量不足,会致使测定结果偏低; 反之,当甲醛含量 ? 30? ? ? ? 南? 方? 水? 产 ? 第 4卷 图 5? 乙酰丙酮用量对吸光度的影响 F ig?5? Effects of acetyle acetone dosage on the absorbency of reaction solution 一定时, 显色剂用量太多, 也会使测定结果偏低。 此实验结果表明,当样液中甲醛含量大于 12 ?g ? mL - 1时, 加显色剂乙酰丙酮溶液 2 mL 与加 1 mL 相比,样液稀释 10倍后的吸光度值明显要大一些 (图

22、5)。在实际检测过程中,当乙酰丙酮用量确定 为 1 mL时,可根据样品中甲醛含量的多少, 选择 合适的取样量或稀释倍数。 2?5? 浸泡时间对吸光度的影响 取市售冰鲜龙头鱼和鲜活罗非鱼肌肉样品 (鲜活罗非鱼肌肉中不含甲醛或者含量甚微, 在罗 非鱼肌肉样品中均添加 20 ?g?g - 1甲醛进行测定 ), 分别于冰浴中浸泡 5、 10 、 20和 30 m in后测定。 实验结果表明, 浸泡时间为 10 m in时样品吸光度 值最高(图 6)。当浸泡时间达到 10 m in后,随着 浸泡时间的延长, 甲醛含量不升反而略有下降。这 很可能与甲醛性质有关,当浸泡时间延长, 样品中 游离出来的甲醛会与

23、浸泡液中逐渐增多的水溶性的 蛋白质、胺类化合物中的游离氨基酸作用, 结合到 蛋白质等分子上, 沉淀蛋白质后过滤时随蛋白质等 杂质一起滤去而有一定损失。此外,随着浸泡时间 的延长, 甲醛也会有一定的挥发。 2?6? 回收率 向已知甲醛含量的样品中加入一定量甲醛标准 溶液,测定结果之差与加入甲醛量之比即为回收 图 6? 浸泡时间对吸光度的影响 Fig?6?Effects of soaking ti me on the absorbency of reaction solution 率。取同一海水鱼肌肉样品,分别采用浸泡法和蒸 馏法前处理样品做回收率实验, 每一加标量做 3个 平行, 结果见表 1

24、。采用此方法即浸泡法前处理样 品的回收率明显高于蒸馏法前处理样品的回收率, 浸泡法处理样品的回收率在 89?50 % 94?25 % 之 间,蒸馏法前处 理样品的回收 率在 64?17 % 76?92 % 之间。 2?7? 精密度 称取 6份 5 g (精确到 0?01 g) 同一海水鱼肌 肉样品,采用浸泡法前处理样品作精密度实验,结 果见表 2 。6次测定的标准偏差( S) 为 0?58 ,相 对标准偏差 ( RSD, % ) 为 2?93 % ,其方法的精密 度符合分析的要求。 2?8? 检测限 用分光光度法检测样品,以扣除空白值后的吸 光度为 0?01相对应的浓度值为检测限,即检出限 L

25、= (标准质量 ! 0?01) /(标准吸光度 - 空白吸光 度 ) 1。此方法样品中甲醛的最低检出浓度为 0?9 mg ?kg - 1。 3? 讨论 近年来国内外学者的研究表明,甲醛是细胞 代谢的中间产物,因此,各种食物中均含有一定 量的 天然甲醛 # 7。李绮等 8报道中国一些香菇 ? 第 6期 ? 马海霞等: 分光光度法测定水产品中甲醛含量的研究 ? 31? ? ? 表 1? 甲醛测定回收率实验 Tab?1? Results of the recovery experi m ent in for m aldehyde determ ination 添加甲醛量 /?g ? g- 1 FA

26、added41020 浸泡法 /?g ? g- 1 soakingmethod X1 23?5827?9437?51 X2 23?9428?8237?10 X3 23?2829?5838?93 平均值 average23?6028?7837?85 本底含量 /?g ? g- 1intrinsic FA a mount 19?83 回收率 /% recovery94?2589?5090?10 蒸馏法 /?g ? g- 1 distillationmethod X1 22?6328?0331?85 X2 23?3026?8732?78 X3 22?4727?5433?25 平均值 average2

27、2?8027?4832?62 本底含量 /?g ? g- 1intrinsic FA a mount 19?79 回收率 /% recovery75?3176?9264?17 表 2? 甲醛测定精密度实验 Tab ?2? Results of precision tests in formaldehyde deter m ination 测定次数 testing ti mes 123456S 相对标准偏差 /% RSD 本底含量 /mg ? kg- 1 intrinsic FA amount 20?1219?7018?9320?4219?1319?960?582?93 平均值 /mg ? kg

28、- 1 average 19?71 品种中的甲醛本底含量可高达 45mg ?kg - 1; 马敬军 等 9也报道在对虾、鳕鱼、鳗鲡及很多水产品中 都检测到甲醛,且甲醛量多在 0?1 31?8 mg ? kg - 1 之间,其中冻鳕鱼甲醛含量最高可达 200 mg? kg - 1。 ? 水产品中的甲醛存在方式可分为 3类, 即以游 离状态、可逆结合状态和不可逆结合状态存在 9。 然而,水产品中各种存在状态的甲醛的含量以及比 例目前还不清楚。采用蒸馏法前处理样品测定甲醛 时, 由于是在磷酸酸性介质中提取,而且又经高温 处理,样品中的一些成分会发生一系列的化学变 化, 产生醛、酮类物质,会干扰比色测

29、定结果; 范 荻等 3的研究也表明, 用蒸馏法前处理样品测定 食品中甲醛含量时,食品的成分、磷酸的用量和浓 度对甲醛测定存在比较大的影响。 在此实验中发现,同一海水鱼样品用浸泡法前 处理时所测得的结果与用蒸馏法前处理是一致的; 回收率实验表明,随着甲醛添加量的增加,浸泡法 的回收率明显高于蒸馏法(表 1)。蒸馏法的回收 率相对较低,很有可能是因为甲醛在高温条件下有 一定程度的挥发所致;而浸泡法由于是在冰浴之中 前处理样品,温度较低, 条件相对温和, 甲醛不易 挥发, 食品中的各种化学成分也不容易发生太大的 变化, 干扰物质较少,所以浸泡法所测结果精密度 好,回收率相对要高一些。 由于蒸馏法前处理样品需特殊蒸馏装置, 反应 条件剧烈, 操作繁琐,耗时较长;而浸泡法前处理 样品反应条件温和, 操作相对简单、快速,回收率 ? 32? ? ? ? 南? 方? 水? 产 ? 第 4卷 和精密度都比较高,适合大批量样品的处理和检 测, 在实际工作中更便于推广。 参考文献: 1 王叔淳. 食品卫生检验技术手册M .3版. 北京: 化学工业 出版社出版,2002 . 2 中国标准出版社第一编辑室. 无公害食品标准汇