SNP标记.ppt

1、RFLP， SNP标标记原理及应用,分子标记法,四、 RFLP标记,定义：RFLP即DNA限制性片段长度多态性，它是指应用特定的核酸限制内切酶切割有关的DNA分子所产生出来的DNA片段在长度上的变化。对于每一个DNA/限制性内切酶组合来说，所产生的片段是特异性的，它能作为某一DNA（或含这种DNA的产物）所特有的“指纹”（即片段差异的多态性）。 基本原理：RFLP标记是由于不同基因型之中内切酶位点的碱基插入、缺失、重组或突变 ,利用限制内切酶消化基因组DNA 时 , 会产生大小,RFLP标记,不同的 DNA 片段 ,电泳后通过Southern 印迹杂交,将这些大小不同的 DNA 片段转移到硝酸

2、纤维膜或尼龙膜上 ,然后用特异的探针进行杂交 ,最后通过放射性自显影或其他显色技术显示杂交结果 ,从而揭示出 DNA 的多态性。,RFLP的方法步骤,DNA的分离 （ 可用SDS法） 酶切(依基因组总DNA的复杂性选择限制性内切酶） 琼脂糖凝胶电泳（分离酶切片段） Southern印记转移（碱法） DNA杂交及放射自显影（预杂交，杂交，洗模，检测） X线胶片上RFLP图谱分析,RFLP的操作流程,RFLP具有以下特点：,RFLP遍布低拷贝编码序列，并且非常稳定，但RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，不适于大规模的分子育种。 可以用来测定多态性是由父本还是母本产生的，也可用来测定由多态性

3、产生的突变类型究竟是由碱基突变或倒位、 还是由缺失、插入造成的。,RFLP的应用,1.遗传学图的构建 结合RFLP连锁图，任何能用RFLP探针检测出的基因及其DNA片段都可以通过回交，快速有效地进行转移。 2.基因定位 利用RFLP技术能够准确地标记定位种质中的目标基因，结合杂交，回交及组织培养等技术就可以快速有效的将所需目标基因的DNA片段引入栽培品种中，实现品种改良。,RFLP的应用,3.遗传多态性分析 运用RFLP技术可以尽可能多地保存那些在已知位点上有异态的品系，以求最大程度地保持品种的多样性。 4.细胞质遗传研究 RFLP技术是对DNA序列自然变异的直接检测，只需选择 适当的限制性内

4、切酶或DNA探针作分子标记，因而对植物不同种属或杂种后的的细胞质遗传变异及基因型的鉴定具有较高的灵活性和灵敏性。因而能较好地应用于细胞质遗传的研究。 ,SNP标记,基于DNA芯片技术的分子标记技术 核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是美国学者Lander E于1996年提出的第三代DNA遗传标记。由于单个核苷酸改变而导致核酸序列多态，即基因中的点突变。SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异。人类基因组大约每 1250 bp SNP 出现一次，已有2000多个标记定位于人类染色体，对人类基因组学研究具有重要意义。检测 SNP 的最佳方法是

5、DNA 芯片技术。,位于基因组内的SNP可以分为2种形式: 一是基因编码区的突变 ,主要分布于基因编码区内(coding region) ,故又称其为cSNP; 二是遍布于基因组非编码区的大量单碱基变异 ,又分为基因周边SNP (peripheral SNP, pSNP)及基因间SNP ( intronic SNP, iSNP) .研究表明基因周边SNP频率比基因编码区SNP频率高。,SNP标记技术，主要包括两个方面：SNP位点的发现和SNP分型。 发现SNPs方法:包括直接对PCR产物进行测序、用鸟枪法从基因组文库以及EST文库筛选序列等技术来筛选或检测SNPs。通常从待测定的基因或ESTs

6、提供的序列设计引物，扩增出目的片段，对扩增产物进行双链测序。然后，还要对所得序列进行排序并仔细鉴别真正的多态性和由于测序误差而产生的差异。也可以通过生物信息学相关软件查找预测SNP。,SNP的检测方法分成四大类: （一）基因芯片技术 基因芯片技术：是在固相支持介质上进行分子杂交和原位荧光检测的一种高通量SNP分析方法。 （二）Taqman技术 在PCR反应系统中加入2种不同荧光标记的探针，他们分别与两个等位基因完全配对。探针运用了荧光共振能量转换技术，探针的5端和3端分别用特殊染料标记，称为供体-受体染料对或爆-猝灭燃料对。,（三）分子信标技术 与Taqman技术相似，分子信标技术也是在PCR反应体系种加入荧光标记的探针与靶序列杂交，通过仪器检测荧光值的变化，进行基因分型。 （四）焦磷酸测序法 焦磷酸测序法是一种不依赖平板胶或毛细管电泳，不依赖DNA的荧光标记/激发/检测体系的序列分析技术，适用于已知SNP的序列验证及基因分型。,SNP的应用,1、人类基因单体型图的绘制 2、SNP与疾病易感基因的相关性分析 3、指导与药物设计 通过研究SNP与个体对药物敏感或耐受的相关性研究，可能阐明遗传因素对药效的影响，另外，随着SNP的研究与药物基因组学的结合，根据特定的基因型来设计药物将成为可能。,SNP优缺点：,优点：（1）SNP具有共显性