第十四章-基因重组与基因工程lj.ppt

1、第十四章 基因重组与基因工程,第一节 自然界DNA重组和基因转移,第二节 重组DNA技术,克隆（clone）,克隆即指同一副本或拷贝（copy）的集合；获取同一拷贝的过程叫克隆化。,自众多分子中分离获得相同分子，即为分子克隆，在分子生物学和遗传学领域所谈的分子克隆专指DNA克隆.,DNA克隆(DNA cloning)：应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程。DNA克隆又称基因克隆（gene cloning）, 基因工程,重组DNA技术（rec

2、ombinant DNA technology）： 实现基因克隆所采用的方法及相关的工作。,克隆体系： 目的基因 载体DNA 工具酶 宿主细胞,1、目的基因（target gene）：cDNA或基因组DNA,cDNA （complementary DNA）：指体外经反转录合成的，与RNA （常指mRNA）互补的单链DNA,单链cDNA进而合成双链cDNA。,基因组DNA（genomic DNA）：代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列，称为基因组DNA。,2、载体(vector)：质粒、噬菌体、柯斯质粒载体、病毒和人工染色体等,质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的小型环状双链

3、DNA分子，在细胞中可以独立进行复制并在细胞分裂时恒定地传给子代细胞。,质粒载体,理想质粒载体的条件： 1、环状DNA，具有自主复制能力； 2、具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体DNA分开； 3、分子量相对较小（2kb数百kb），能够容纳目的基因； 4、具有较多单一限制性内切酶位点； 5、有一个或多个筛选标记； 6、具有较高的遗传稳定性。,The constructed plasmid pBR322,质粒载体,外源基因插入位点EcoR 含一个复制起始点（ori） 抗药基因terr和ampr,1977年由Boliver和Rodriguez等人自E.coli的天然质粒建成。,1、克隆载体,An

4、 example of an E. coli expression vector,质粒载体,2、表达载体,外源基因插入位点 复制起始点（ori） 标记基因 启动子 调控序列,3.1 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease): 存在于细菌体内，能够识别和切割双链DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶。,3、工具酶：,许多限制性核酸内切酶II的识别序列属于回文结构 回文结构：DNA的两条链呈旋转对称，即中心轴两侧的碱基序列为互补序列。,【经典举例】Eco RI,限制性核酸内切酶,限制性内切酶切割产物：具有5磷酸基和3羟基基团 由于酶的作用不同可以产生三种切割末端。,（1）

5、5突出末端：如Eco RI,酶识别DNA序列的长短不同，一般为4-18bp,（3）平头钝性末端：如Hpa I,限制性核酸内切酶,（2）3突出末端：如Pst I,3.2 DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow片段 (Klenow 酶)、T4 DNA聚合酶以及Taq酶等,3.3 DNA连接酶 T4 连接酶：可用于粘端与平端的连接,4、宿主细胞：大肠杆菌、酵母、动物细胞,分、切、接、转、筛、表达,第三节 DNA克隆的基本过程,一、“分”：目的基因及载体的制备,1、分离基因的方法：化学合成、基因组DNA、 cDNA 、 PCR、,基因组DNA文库(genomic DNA library)：

6、利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组DNA信息，总称基因组DNA文库,cDNA文库(cDNA library)：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有cDNA信息，总称cDNA文库 。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。,聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）：在反应体系中加入模板DNA、dNTP、特别设计的特异引物及耐热的DNA聚合酶（常用Taq酶），经多次变性、退火、延伸循环反应，使目的DNA呈指

7、数合成的过程,2、常用载体：质粒、噬菌体、病毒DNA,克隆载体（cloning vector）：用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等,表达载体(expression vector)：用于在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物,二、“切”：限制性内切酶切割目的基因和载体DNA,一、粘性末端连接,1、同一限制酶切割位点连接，碱基配对结合成重组分子。,2、不同限制酶切割位点连接，因有相同末端，经配伍后连接,三、“接”：重组体的构建,重组体构建,二、平端连接,平端在T4连接酶作用下可以连接。,三、同聚物加尾连接,利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的互补作用完成连接，需末端转移酶

8、。,四、人工接头连接,用人工合成某酶切割序列的接头，与DNA平端相连后形成粘性末端再连接。,重组体构建,重组体构建,2、转染（transfection）：将外源DNA导入真核细胞的过程,3、感染（infection）：以l噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。,四、“转”：重组DNA分子导入受体细胞,1、转化（transformation）：将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞(常用大肠杆菌)，并使其获得新的表型的过程,五、“筛”：筛选出含重组DNA的受体细胞,抗药性标志选择,含抗药性基因的载体（ampr

9、 ,Tetr, Kanr）转入的细菌，可在含该药物的培养板上形成菌斑，进行初步筛选。,重组子的筛选,例如：,Screening for desired recombinant by antibiotic resistance genes (clones 2, 5, and 8),六、“表达”：使克隆基因在宿主细胞中复制、表达,1、外源基因在原核细胞的表达,大肠杆菌是最常用的原核表达体系,2、真核表达体系,酵母、昆虫及哺乳动物细胞等 表达产物更接近天然蛋白质,基因工程的基本步骤,1、分,2、切,3、接,5、筛,4、转,6、表达,疾病基因的发现、发展新药物、DNA诊断、基因治疗及遗传病的防治,一、

10、疾病相关基因分析,1、功能克隆（functional cloning）：根据基因的功能（通常是根据其蛋白质）产物来寻找、克隆与疾病相关的基因,2、定位克隆（positional cloning）：从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因,二、制造生物活性蛋白,第四节 重组DNA技术与医学,基因工程产品,A tobacco plant in which the gene for firefly luciferase is expressed. Light was produced after the plant was watered with a solution conta

11、ining luciferin, the substrate for this lightproducing enzyme (see Box 13-3, Fig. 2). Dont expect glow-in-the-dark ornamental plants at your local nursery anytime soon; the light is actually quite weak and this photograph represents a 24 hour exposure. The real point-that this technology allows the introduction of new traits into plants-is nevertheless elegantly made.,转基因植物,基因工程的应用,转基因动物,三、基因诊断,基因诊断：利用分子生物学的基本原理和技术，在DNA或RNA水平上分析、鉴定与某些疾病有关基因的改变（基因结构及其表达水平的异常）,遗传病的产前诊断、感染性疾病的快速诊断、某些