DNA甲基化检测方法

1、DNA甲基化检测方法概述，主要检测方法，基于亚硫酸氢盐转化的方法(金标准)，基于亚硫酸氢盐转化的方法，基于亚硫酸氢盐转化的方法，质谱，水解核苷酸质谱，基于亚硫酸氢盐转化的甲基化分析原理1，基于亚硫酸氢盐转化的甲基化分析原理2，使用：直接测序法，用于甲基化分析的样品通常是混合样品，不适合直接桑格测序分析。直接测序法，图6，PMVK基因扩增产物的反向测序结果，图7，TRIB3基因扩增产物的正向测序结果，使用两种：亚硫酸氢盐-序列聚合酶链反应(BSP)，注：A:癌组织；b:癌旁组织；未甲基化；甲基化，43a，43b，(369bp)，43b，bsp克隆测序结果，BSP克隆测序甲基化率三维图，advan

2、tage :能准确检测每个DNA分子单倍型的甲基化状态，并分析不同CpG位点甲基化状态之间的关系。缺点：聚合酶链反应产物需要克隆，这是繁琐，耗时和劳动消耗，克隆的数量影响结果的准确性。测序重复性差。用甲基化特异性聚合酶链反应(ms-PCR)、100、150、200、250、MSP法检测肿瘤抑制基因RASSF1A启动子区的甲基化，用MSP法检测组织切片DNA甲基化状态的电泳图谱，甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)结果显示u为非甲基化。MSP扩增产物的凝胶电泳，研究结果，注：M表示甲基化，U表示未甲基化B1-B6是高脂血症组的6个样品，D1-D5是正常对照组的5个样品；H2O是阴性对照。m是50b

3、pMarker。SREBP基因启动子区CpG岛甲基化状态，甲基化特异性聚合酶链反应，优点：操作简单；高灵敏度；巢式聚合酶链反应提高了灵敏度，便于分析微量检测的缺点：引物设计要求高；只能进行定性研究；亚硫酸氢盐处理不完全导致假阳性；只有一些位点的甲基化状态是已知的。用Taqman探针对MSP产物进行甲基化、甲基化、qPCR，从而实现甲基化的定量分析。优点：增加了亚硫酸氢盐转化和脱氧核糖核酸复性的质量控制，避免了电泳、酶消化等缺点。聚合酶链反应偏倚，应用4:联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)，联合亚硫酸氢盐限制性酶法，基于限制性酶的工具酶，甲基化特异性限制性内切酶(MDRE):能识别甲基化胞嘧

4、啶，甲基化敏感限制性内切酶(MSRE):能识别甲基化胞嘧啶，基于限制性内切酶的甲基化分析方法，MSRE-聚合酶链反应原理，图1-1 MSRE-聚合酶链反应示意图注：左边的脱氧核糖核酸未甲基化，脱氧核糖核酸被切断，无法获得聚合酶链反应产物；在右边，脱氧核糖核酸被甲基化，脱氧核糖核酸保持完整，可以获得聚合酶链反应产物。应用实施例2:甲基化敏感限制性酶技术结合聚合酶链反应(used聚合酶链反应)用于筛选肝癌和邻近组织之间具有甲基化差异的基因。注：m:标记；e:加酶系统；a:癌症组织；b:癌旁组织；空的：水是空的，酶识别位点包含一个或多个CpG位点。应用条件：限制性内切酶法结合亚硫酸氢盐，优点：方法相

5、对简单；可以进行甲基化水平的定量研究；所需的样本量很小。缺点：由于CG仅限于核酸内切酶识别序列，非识别序列的CG将被忽略；只有当检测到与转录相关的关键位点的甲基化状态时，这种检测方法的结果才有意义；存在酶消化不完全导致假阳性的问题；结合亚硫酸氢盐限制性内切酶法，应用5:限制性消化和实时聚合酶链反应(qamp)，基本步骤，实施例：在小鼠睾丸和肝脏中印迹基因u2af1-rs1的差异甲基化区域的评估，引物被设计在DMR区域的Notl(N)、Hhal(Hh)和McrBc(M)限制性位点的侧面。肝和睾丸基因组DNA模板在无酶消化后进行聚合酶链反应扩增。使用第二个引物对进行扩增，该引物对被设计成不含限制性

6、位点的序列，证明模板具有相同的浓度。酶消化模板相对于假消化模板的Ct值的差异决定了每个组织中的DNA甲基化水平。MSRE，MDRE，应用6:基于亲和纯化的甲基化分析方法，应用7: ChIP-Seq技术，ChIP-Seq，应用8:ChiP技术在甲基化检测中的应用，启动子甲基化芯片技术，基因芯片杂交信号图，九，利用质谱分析半胱氨酸甲基化通过碱基特异性清除和引物延伸的方法，每个片段切割如图所示包含一个或两个CpG位点。在质谱图上，甲基化片段和非甲基化片段的大小差异为16Da或32 da，碱基特异性切割，引物延伸方法，如图所示，延伸被ddC和ddT终止后，质谱图显示甲基化基团(ddC)和非甲基化基团(

7、ddT)的质谱峰，它们之间的差异为16Da。碱基特异性切割检测酶切后片段的甲基化状态，用于筛选长序列(如基因启动子区)中的甲基化位点，并确定每个甲基化位点的甲基化程度，而引物延伸法可以在确定基因的甲基化谱后，准确定量地检测每个CpG位点的甲基化程度，引物延伸法可以同时检测多达25个位点。质谱检测的优点：灵敏度高，准确度高。并且操作简单。局限性：脱氧核糖核酸样品需要高纯度，提取过程中的小离子，未消化的蛋白质和干扰结果的核糖核酸。需要质谱仪。10.甲基化敏感单核苷酸引物延伸(MS-SNUPE)、扩增、基因组DNA样品、亚硫酸氢盐转化、ExoSAP消化、聚合酶链反应、引物延伸、添加SNP引物和SNa

8、Pshot Mix、SNP引物延伸(添加ddT或ddC)、SAP处理、分析、向310/3100样品中添加GS120LIZ内标物、用于ABI310/3100电泳的E5和POP4凝胶、基因扫描、样品分型(基因组类型或基因图谱)，步骤1、步骤2、步骤3、步骤4、步骤5、步骤6共检测到6个CpG位点，阴影峰代表甲基化C，空白峰代表未甲基化C.位点1、2和4显示约50%的甲基化率，而位点3、5和6显示0%的甲基化率。应用XI:高分辨率熔融曲线分析质谱-高分辨质谱技术，高分辨质谱技术：用于筛选大量样品，获得感兴趣的氯化聚乙烯位点，识别感兴趣的氯化聚乙烯岛。人力资源管理技术原理，人力资源管理技术原理，人力资

9、源管理特点，高灵敏度：它可以检测甲基化程度低至0.1%。高通量：一次检测不超过384个样本，适用于大样本的多位点甲基化扫描。高重复性：100%重复性。应用范围广：不受基地限制。操作简单：只需设计特异性引物，无需序列特异性探针，无需测序。标本范围广泛：可用于检测新鲜或酒精固定、石蜡包埋的手术标本，以及微穿刺或活检标本、血液标本、粪便标本和其他非手术标本。缺点：检测序列的长度不应超过100bp；只能进行半定量检测。应用十二焦磷酸测序法、焦磷酸测序法、焦磷酸测序法、焦磷酸测序法、焦磷酸测序法、焦磷酸测序法的优点是：灵敏度高，可以检测相邻CpG区的单个甲基化水平，甚至包括用于测序的引物区。除了常规的检

10、测位置变化，频率变化也可以精确计算。对检测位点要求低，可以检测未知序列信息，覆盖人类基因组的所有CpG位点；样品要求低，适用于新鲜、冷冻和FFPE样品。应用十三：通过重甲基双重聚合酶链反应定量甲基化的脱氧核糖核酸，重甲基的原理(一)当脱氧核糖核酸甲基化时，阻断寡核苷酸(实心黑色)不结合，留下引物可到达的引物结合位点(灰色箭头)来结合和扩增靶。扩增用甲基化特异性寡核苷酸探针固体黑色检测，在5-核酸外切酶分析中用荧光染料和淬灭剂标记，这里用作实时检测方法的例子。当脱氧核糖核酸未甲基化时，阻断寡核苷酸结合，阻断引物进入它们的结合位点。不产生聚合酶链反应产物。样本吞吐量与基因组覆盖率。各种脱氧核糖核酸甲基化技术的样品通量与基因组覆盖率的关系图。基于大型真核生物基因组，通过每个实验可以分析的样本数量来确定吞吐量。覆盖率由每个实验可以分析的基因组中的CPGS数决定。不同甲基化检测方法的检测通量。筛选差异甲基化区域；项目的过程。对所选DMR进行测序，以验证是否存在甲基化差异，并筛选出与年龄相关性强的CpG位点；3.检测每个样品中CpG位点的甲基化率并进行回归分析。回归分析需要大量样本，每个样本需要检测多个CpG位点。基于克隆的桑格测序需要多个克隆，操作繁琐，重复性差，成本高；焦磷酸测序需要对多个片段进行测序，所以样本量太大，成本也不会小。