第五章目的基因的获取.ppt

1、第五章目标基因的获取，通过化学合成技术筛选基因库聚合酶链反应转座子标记法基因差异显示技术生物信息技术分离和鉴定酵母双杂交系统分离，目标基因的获取：(1)化学合成法的单元操作，从反应机理上分为：磷酸二酯法，磷酸三酯法，亚磷酸三酯法和自动合成法。操作过程：液相合成，固相合成，1。化学合成：首先，待合成的寡核苷酸链的3-末端与不溶性载体相连，如多孔玻璃珠、二氧化硅等。然后从3-5个方向依次加入核苷酸单体，所用核苷酸单体的活性官能团全部被保护，其中5-羟基被二甲氧基三苯甲基(DMT)保护，磷酸在3-末端被亚磷酸二丙酯保护。固相亚磷酸三酯法原理：亚磷酸三酯法合成工艺，DMT:二甲氧基三苯甲基，酸(三氯乙

2、酸)洗涤柱，1个核苷酸连接柱，1个核苷酸保护，磷和氧原子保护基团：氰乙基，活化：氨基亚磷酸酯化合物，亚磷酸三酯，2个核苷酸活化，缩合反应，氰乙基，亚磷酸二异丙酯，亚磷酸二异丙酯，氧化反应，35-磷酸二酯键，引物，接头，探针等。1.小片段结合法：根据目的基因的完整序列，分别合成长度为12-15个碱基的单链DNA片段；2.基因组装策略：预先设计的合成片段之间存在互补区域，不同片段之间的互补区域可以形成带断点的完整双链。一、粘端二、贴片延伸法：根据目的基因两条互补链的全序列，分别合成长度为12-15个碱基的小单链DNA片段和长度为20-30个碱基的中间单链DNA片段，预先设计的短片段与长片段的某一序

3、列互补。3.大片段酶法：根据目的基因的完整序列，分别合成长度为40-50个碱基的单链DNA片段。在预先设计的片段之间有局部互补区，可以用作另一个片段延伸的引物。(3)利用脱氧核糖核酸化学合成，合成天然基因：胰岛素基因、干扰素等。有些基因很短，化学合成的成本很低。修饰和转化基因，设计新基因。“人工孩子”2010年5月20日，美国一位64岁的科学家花了10年4000万美元用计算机设计并转化了基因，然后用化学方法合成了基因，并将其引入支原体细菌，DNA像正常细菌的基因一样被复制，人工生命诞生了。探针、引物和接头的制备定点突变合成：定点突变基因片段的合成。其次，通过聚合酶链反应技术获得目的基因，逆转录

4、聚合酶链反应：以逆转录合成的第一条基因链为模板。引物：基因侧编码区引物，寡核苷酸(dT)12-18，氨基酸序列设计特异性引物：简并引物反向聚合酶链反应：以含有已知区和未知区的环化DNA分子为模板，根据已知区序列设计引物，扩增未知区序列的聚合酶链反应技术。模板、模板、3、5、3、5、3。筛选基因库，基因库：特定生物体(自然存在)的完整基因组的集合。每个种群都有自己独特的基因库。基因库或基因库是通过克隆在合适的宿主细菌中储存一定的基因组DNA或mRNA而形成的转化子群。所有的脱氧核糖核酸组合代表了基因组的完整序列。基因组文库和cDNA文库。根据不同的构建方法，基因库可以分为：(1)基因库的容量和完

5、备性，所构建的基因库中任何基因的存在概率，以及它与基因库中最小克隆数N的关系可以用以下公式表示：N=ln(1-P)/ln(1-f) P=任何基因被克隆(存在于基因库中)例如，人类单倍体DNA的总长度为2.9109bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15kb，因此构建一个完整度为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；当完整性增加到0.9999时，基因库至少需要180万个克隆。基因文库的完整性：在构建的基因文库中任何基因的概率。完整性越高，库容量越大。(2)理想的基因库条件：1)完备性高，筛选任何基因的概率应为99%；2)重组克隆的总数不应太大；3)载体的承载能力应大于基因的长度；4)克隆之间必须

6、有足够长度的重叠区域；5)克隆的片段易于从载体分子中完全去除；6)重组克隆可以稳定保存、扩增和筛选；3)基因组文库的构建过程。基因组文库：包含生物体基因组所有遗传信息的一系列DNA片段，通过克隆载体储存在受体细菌群体中。这个群体被称为这种生物的基因组文库。文库中所有克隆携带的DNA片段的重组可以覆盖生物体的整个基因组。(4)基因组文库的构建步骤，1)基因组DNA的制备和切割(以确保DNA片段之间有部分重叠；DNA片段大小一致)通过超声波处理进行部分限制性酶消化；2.载体和受体选择性基因组文库：-DNA或Coss质粒；大基因组利用基因文库构建载体：质粒；受体：大肠杆菌或酵母；3.DNA片段和载体

7、之间的直接连接，人工连接或均聚物尾部添加。清洗培养皿上的所有细菌并保存它们。4、用重组体转化宿主细胞，构建基因组文库的初级库，5、扩增初级库形成最终库，5、构建cDNA文库，其中将某一生物的mRNA反转录产生的cDNA片段分别与合适的克隆载体连接，并通过转化储存在受体细菌群体中，这一含有某一生物基因群的所有cDNA的受体细菌群体称为生物cDNA文库。cDNA文库的特征(1)不含内含子序列。(2)可在细菌中直接表达。(3)它包含所有编码蛋白质的基因。(4)它比文库小得多，易于构建。1.提取总核糖核酸：1)提取总核酸并用氯化锂沉淀核糖核酸；2)异硫氰酸胍一步法3)改进的十六烷基三甲基溴化铵法提取总

8、核糖核酸。4)使用商业试剂盒Trizol提取总核糖核酸。其原理是在酸性条件下直接提取总核糖核酸，其中脱氧核糖核酸和蛋白质进入有机相，而核糖核酸保留在水相中。2。基因的纯化，(1)寡核苷酸纤维素亲和层析，将总核糖核酸置于高盐缓冲液中的柱上，带有多聚腺苷酸尾的基因与寡核苷酸在柱中结合，然后用中盐洗涤柱以除去核糖核酸和tRNA。用蒸馏水或低盐冲洗柱子以获得基因。是一种商用寡dT纤维色谱柱。基因仅占总核糖核酸的1%-2%。(2)用磁珠法纯化基因，用总核糖核酸纯化试剂盒获得总核糖核酸，并将其加入聚腺苷酸基因分离系统。生物素标记的双链脱氧核糖核酸引物与总核糖核酸一起孵育，抗生物素蛋白微球被强磁场吸附，从而

9、与抗生物素蛋白配对的杂交核糖核酸被吸附。聚腺苷酸通道基因的分离纯化过程，磁分离，3。cdna的合成，cdna第一链的合成，寡核苷酸(dt) 12-18，cDNA第二链的合成，自导向方法：在所获得的DNA双链的5末端有碱基缺失，以及替代合成方法：在所获得的双链cDNA的5末端有几对碱基缺失，但是通常它不影响编码区的完整性。大肠杆菌脱氧核糖核酸聚合酶，导向合成法：获得的双链脱氧核糖核酸可以保留完整的5-末端序列，但操作复杂，不利于重组体的复制和测序。，4。双链cDNA的克隆，钝端直接与载体连接，钝端分别与均聚物尾连接：优选AT均聚物尾，重组体可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入物。加入人工接

10、头或接头引入酶切，便于回收插入物，钝的cDNA可通过以下三种方法克隆到载体中：(6)从基因组文库中筛选目的基因，提取、纯化和酶切探针杂交阳性克隆质粒，探针：目的基因的局部片段，从氨基酸序列获得的简并序列，相关物种的同源序列；4.转座子标记法获得目的基因；(1)关于转座子转座子(TN) :的知识是指位于染色体上的可以从基因组的一个位置转移到另一个位置的DNA片段或基因。(跳跃基因)简单转座子：一种转座子，除了转座所需的基因外，不携带任何标记基因。IS复合转座子：一种转座因子，除了转座所需的基因外，还携带某种标记基因。TnA族，副本置换：在置换过程中，首先复制副本，然后将副本置换到新位置，原始置换

11、系数仍保留在原始位置。非重复换位：直接从原位置换位，插入新位置，并停留在插入位置进行动作。反转座子：通过转录合成基因，然后通过反转录合成新的脱氧核糖核酸元件并整合到基因组中完成转座。()Ac自主因子：自主剪接和转座的功能Ds自主因子：独立的存在和稳定性，它要求同一系列的自主因子为转座功能提供转座酶。自主因子和非自主因子：玉米转座子Ac/Ds系统，()Ac-Ds系统：控制色素基因C. C基因的表达：位于9号染色体，控制紫色。插入Ds: C基因的C基因失活，玉米不是紫色的。Ac:在一定程度上激活Ds，使Ds跳到其他位置，那么c基因就会恢复，紫玉米就会出现。在Ac存在的情况下，Ds不断跳跃，这使得它

12、控制的颜色基因打开和关闭，从而显示玉米颗粒上的斑点。(2)转座子标记，将转座子插入到待克隆基因中或其附近，使目的基因发生突变，然后以转座子DNA为探针筛选突变株的基因组文库，捞出含有转座子的DNA片段。然后，将筛选出的阳性克隆中的目的基因片段作为探针，筛选野生型生物基因库，分离目的基因。通过转座子标记、目标标记和非目标标记获得目标基因的过程；5.基于图谱的克隆为了获得目标基因，基于图谱的克隆，也称为定位克隆，是由剑桥大学的Alancoulson在1986年首次提出的。根据目标基因在染色体上的位置，不需要事先知道该基因的DNA序列，也不需要事先知道其表达产物的相关信息。染色体行走，以与目的基因紧

13、密连锁的分子标记DNA片段为探针筛选基因组文库，以获得的阳性克隆DNA的末端片段为探针继续筛选，直至获得含有目的基因两侧的序列。(1)利用遗传作图将目的基因定位在染色体的特定位置；2)寻找与靶基因紧密连锁的分子标记；3)构建包含大插入片段的基因组文库(文库或);4)用与靶基因相连的分子标记作为探针筛选基因组文库；5)利用获得阳性克隆构建目标基因区域的交叉聚类；6)通过染色体行走获得含有目的基因的大片段克隆；7)通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆；染色体行走的基本过程，由一系列从头到尾重叠的探针筛选，类似于通过一系列重叠的克隆从分子标记序列到目标基因的“行走”，因此称为染色体行走。6.基因差

14、异显示技术可以获得差异表达基因，是分离组织特异性或诱导特异性表达基因的有效方法之一。一种将基因反转录和聚合酶链反应技术相结合的核糖核酸指纹技术，也被称为聚合酶链反应的理论基础，(1)3-末端锚定引物，(2)3-末端有两个核苷酸的寡核苷酸引物(倒数第二个引物不再是T)。12个锚定引物，(3)5末端随机引物，20个10聚体，AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

15、AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(4)随机引物和锚定引物成对扩增，12种锚定引物和20种随机引物可以形成240套引物，引物组合：实验结果：如果每一条带相当于一个特定的基因，20000个基因基本上反映了特定细胞中的所有基因。240组可以分隔20000多个波段！操作步骤：差异分离目的基因的程序，利用两组细胞的基因，分析比较基因类型的差异，分别回收基因进行测序分析。以该片段为探针，通过筛选文库获得全长基因。它更适合分离和克隆新基因。随机锚定引物聚合酶链反应产物的电泳比较表明，来自不同组织的240组引物组合聚合酶链反应产物在测序凝胶中电泳。选择不同的条带，制备探针，筛选cDNA文库，

16、找到不同基因的全长序列。、消减杂交，原理：从表达靶基因的组织中提取的mRNA被转录成cDNA，然后与从没有靶基因表达的组织中提取的mRNA过度杂交。在两种组织中表达的基因产物形成基因/基因双链杂交分子，而从特定基因反向转录的基因则保持单链状态。分离这种单链的cDNA是差异表达的序列。酵母双杂交系统分离目标基因并有效分离能与已知诱饵蛋白相互作用的蛋白质。许多真核转录激活因子由两个结构域组成，这两个结构域在结构上是分开的，在功能上是独立的。1.结构域合作，(1)酵母双杂交系统的原理，例如：gal4:DNA结合结构域，活性结构域，n，c，1-147aa，768-881aa，上游激活序列(gal4)，转录激活，结合，结合，激活转录，实验发现：转录表达，只要DNA结合域(DNA-BD)和活性域(AD)彼此接近，就能激活转录。2.拆解结构域、DNA结合结