荧光原位杂交技术在临床病埋中的应用

1、荧光原位杂交技术(fish)在临床病理中的应用与质控,荧光原位杂交技术(fish): 用带有荧光素标记的核酸探针与组织细胞中待测的核酸(dna、rna)按碱基配对的原则进行特异性结合，在荧光显微镜下显示细胞基因状态的方法。 fish在临床病理中的应用 辅助病理诊断、判断预后、指导临床治疗,一、常用荧光素及滤光片类型,二、常用探针种类,单色探针(single color probe, sc) 双色探针(dual color probe, dc) 三色探针(triple color probe, tc) 双色分离探针(dual color, break apart probe. dc,bcr) 双

2、色单融合探针(dual color, single fusion. dc, sf trans) 额外信号探针(extra signal. es) 双色双融合探针 (dual color,dual fusion probe. dc,df trans),单色探针(sc),正常,异常,cep8,双色探针(dc),正常,异常,her2,cep17,三色探针(tc),正常,异常,x,y,cep18,双色分离探针(dc,bcr),正常,异常,myc,myc,14,18,14,18,双色单融合探针(dc, sf trans),正常,异常,abl,abl,9,22,9,22,bcr,bcr,额外信号探针(es

3、),正常,异常,abl,abl,9,22,9,22,bcr,bcr,双色双融合探针( dc,df trans),正常,异常,igh,igh,14,18,14,18,bcl2,bcl2,三、fish检测在常见肿瘤中的应用与意义,乳腺癌,探针: her2/csp17（双色探针） her2基因检测意义： her2基目扩增的患者预后差:无病生存和总生存期缩短，淋巴结转移几率高，复发凤险高。 指导内分泌冶疗：her2基因扩增患者对内分泌治疗产生耐药。 指导合理选择辅助化疗方案：her2基因扩增患者宜采用紫杉醇化疗和高强度的蒽环类药物方案。 筛选分子靶向药物的适用者：her2基因扩增患者适合使用曲妥珠单抗

4、药物。,探针：top2a/csp17（双色探针） top2a基因两种异常：扩增和缺失。 top2a基因检测的意义： 存在top2a基因异常的患者预后差，尤其是基因缺失的患者预后更差。 top2a基因异常患者对于含蒽环类药物的治疗方案更敏感。,非小细胞肺癌,探针：egfr/csp7（双色探针） egfr基因异常：扩增和拷贝数增加。 egfr基因检测的意义： 30%40%非小细胞肺癌存在egfr基因异常. 筛选酪氨酸激酶抑制剂适用者：egfr基因增多的患者，应用iressa/tarceva治疗的有效率为35%，疾病控制率高达70%。,egfr (-) 2g + 2r ratio: 2.0, egf

5、r fish (-),egfr (+) ratio: 2.0, egfr fish (+),滤泡性淋巴瘤,探针: bcl2/igh （双色双融合探针） bcl2基因位于18q21， igh基因位于14q32. bcl2/igh融合基因导致bcl2蛋白的过度表达，从而抑制b细胞凋亡，使b细胞持续增殖引发肿瘤。 bcl2/igh融合基因检测意义: 辅助诊断fl ：bcl2/igh重排发生在约80%-85%的fl患者中。 bcl2/igh持续阴性的fl患者3年生存率为100%，而阳性者3年生存率只有54%；阴性者3年疾病无进展的患者87.5%，而阳性者只有13%。,bcl2/igh 正常,bcl2/

6、igh断裂、平衡易位,弥漫性大b细胞淋巴瘤,探针：bcl6（双色分离探针） bcl6基因位于3q27，主要有t(3;14)，t(3;22)和t(2;3)3种易位，分别是bcl6与免疫球蛋白ig的重链(igh)、轻链(igl)、轻链(igk)区域易位。 bcl6 基因断裂检测意义 目前研究确定至少40%的dlbcl涉及3q27染色体易位或者bcl6基因重排。 bcl6阳性患者诊断治疗36个月后，疾病停止发展的比率为82%，携带有bcl6重排的病例预后较好。,bcl6断裂,bcl6正常,套细胞淋巴瘤,探针：ccnd1/igh（双色双分离探针） ccnd1基因位于11q13，igh基因位于14q32

7、。ccnd1/igh融合基因导致ccnd1蛋白过度表达，可促进细胞增生。 ccnd1/igh融合基因检测意义 ccnd1基因重排和(或)高表达是mcl的特征，fish探针检测ccnd1/igh的阳性率可以达到96%。,ccnd1/igh正常,ccnd1/igh断裂易位,伯基特淋巴瘤,探针:c-myc（双色分离探针） 8号染色体上c-myc基因最常见的是t(8；14)，导致8号染色体上c-myc基因和l4号染色体上igh增强子元件并列,也可发生t(2；8)(p12；q24)，或t(8；22)(q24；ql1) c-myc基因断裂检测意义 约80%的伯基特淋巴瘤病例发生t(8；14)（q24;q3

8、2）； 约15%的伯基特淋巴瘤病例发生t(2；8)(p11;q24)； 约5%发生t(8；22)（q24;q11）。 c-myc基因断裂重组可能是伯基特淋巴瘤的一个标志，可以应用于临床上伯基特淋巴瘤的辅助诊断。,c-myc正常,c-myc断裂,malt淋巴瘤,探针： malt1（双色分离探针） api2/malt1（双色双融合探针） api2（11q21）malti（18q21）易位形成api2/malti融合基因，产生api2/malti融合蛋白，导致细胞增殖，引起肿瘤。 malt1及api2/malti融合基因检测意义 10%-20%的粘膜性淋巴组织淋巴瘤中会存在malt1 基因的断裂重组

9、，辅助诊断malt淋巴瘤。 指导针对胃api1/malt1淋巴瘤患者的抗幽门螺旋菌治疗： 存在malt1 基因的断裂重组的患者不适合用抗生素治疗。 预后判断：存在malt1 基因的断裂重组的节外胃淋巴瘤患者更容易出现局部进展期病变。,malt正常,malt断裂,api2/malt正常,api2/malt断裂易位,滑膜肉瘤,探针：syt syt基因位于18q112,又称ssl8或ssxt基因 。 syt基因检测意义 辅助诊断滑膜肉瘤。 文献报道，90以上的滑膜肉瘤中存在染色体易位t(x；18)(p112；q112)，导致位于18q112的syt基因和位于xp112的ssx基因融合。,脂肪肉瘤,探

10、针：mdm2/cen12 mdm2基因检测意义： 辅助诊断高分化脂肪肉瘤。 文献报导：90%高分化脂肪肉瘤中mdm2基因存在扩增。,胃肠道间质瘤,探针：ccnd1/cen11 mdm2/cen12 检测意义： ccnd1基因为重要预后因子，与多种肿瘸的转移、复发等相关。在高凤险们gist中扩增，在低风险和中等风险gist中无扩增，其表达与gist有预后相关性。 mdm2基因扩增宣gist患者有预后相关性。,前列腺癌,探针：pten/cen10 fgfr1/cen8 erg 检测意义： pten基因缺失，前列腺癌患者预后差。 fgfr1基因扩增是前列腺癌患者传递激素抵抗的重要过程。 没有erg基

11、因改变的前列腺癌患者8年生存期达90%。,神经母细胞瘤、神经胶质瘤,探针：1p36/1q25 19q13/19p13 nmyc/2q11 检测意义： 在神经母细胞瘤患者中，1p丢失是强烈的预后差因子，提示临床应采取积极主动的治疗策略； 结合1p，19q基因状态可辅助治疗和预测退行性少突神经胶质瘤的预后效果。 nmyc基因扩增为预后差因子，指导个性化治疗。,黑色素瘤,探针：pten/cen10 检测意义： pten基因缺失导致pi3k/akt（磷酸肌醇3激酶 /丝氨酸苏氨酸蛋白激酶 ）途经激活，指导抗pi3k/akt通路药物。 pten基因缺失的患者预后差。,宫颈cin、宫颈癌,探针：terc/

12、csp3 检测意义： 对于cin1/cin2的患者，terc基因扩增的患者发生进展/恶变的可能性超过50%，需要及时治疗。 辅助明确宫颈cin分级，选择合理的治疗方案。,膀胱癌,探针：csp3/csp7 p16/csp17 检测意义： 膀胱癌9号染色体部分(p16位点)缺失或全部丢失是最常见的遗传学异常之一，这一异常与膀胱癌的旱期发望密切相关。 膀胱癌的发展与染色体不稳定性(如3号、7号、17号染色体的非整倍性)紧密相连。 早期无创性诊断泌尿系统移行上皮癌。 泌尿系统移行上皮癌术后复发监测。,四、fish操作流程,石蜡切片58-60过夜 二甲苯脱蜡，酒精脱二甲苯，水化组织 高压处理组织切片 胃

13、蛋白酶处理组织 干燥组织切片后滴加探针，加盖玻片与封固剂 高温（7395）变性 杂交16小时（过夜） 揭去橡胶水泥和盖玻片,进入杂交后洗涤 酒精脱水、晾干。 滴加dapi荧光封片剂 荧光显微镜下观察,五、fish判读标准,乳腺癌her2基因检测: 20个肿瘤细胞her2基因（红信号）点数总和与cen-17（绿信号）点数总和的比值。 her2/cen-172.2 her2基因有扩增 her2/cen-171.8 her2基因无扩增 her2/cen-17 1.82.2 定为不确定结果。 需重新再进行另外20个的细胞计数或重复fish检测，如仍不确定，则建议临床结合ihc检测her2蛋白表达情况决

14、定是否使用靶向治疗。,cen-17多体性：计算以上计数的20个细胞的绿信号点数均值。 cen-17均值 1.75 亚二体性 cen-17均值 1.762.25 二体性 cen-17均值 2.263.75 低多体性 cen-17均值 3.76 高多体性,非小细胞肺癌egfr基因检测: 50个肿瘤细胞egfr基因（红信号）点数总和与cen-7（绿信号）点数总和的比值。 egfr基因扩增阳性： egfr基因簇状扩增 egfr/cen-72.0 40% 肿瘤细胞红色信号4个,六、fish检测规范与质控,影响fish制片质量的因素 组织处理的规范化: 及时固定:冷缺血时间1h 4%中性缓冲甲醛6-48h 不推荐微波固定 乙醇脱水 浸蜡温度68 不使用快速石蜡组织做fish检测,脱蜡、脱二甲苯 组织消化 变性、杂交的温度 杂交后洗涤液ph值 6周的组织切片不应再用于fish检测,影响fish判读的因素 采用正确的滤光片观察 orange/red 正确判定肿瘤细胞(heihcfish) 肿瘤异质性表达 导管内癌/浸润性癌 浸润性癌不同部位