《血红蛋白的提取和分离》课件

1、主题3:血红蛋白的提取和分离。血红蛋白包含四条肽链，每条肽链围绕一个血红素基团，血红素基团可以携带一个氧分子或一个二氧化碳分子。血红蛋白是红色的，因为它含有血红素。1.基础知识：学生活动1:1.分离生物大分子的基本思想是什么？不同蛋白质的特性有什么不同？在这个项目中，我们将利用血红蛋白和杂质蛋白之间的差异来纯化。我们为什么不用鸡红细胞代替人红细胞作为实验材料呢？5.用什么方法来分离不同相对分子量的蛋白质？1.基础知识-蛋白质提取和分离的原理，蛋白质提取和分离的基础：蛋白质的物理和化学性质：形状、大小、电荷性质和数量、溶解度、吸附性质、亲和力等。(1)原理：(2)材料、大分子通过多孔凝胶颗粒的缝

2、隙，距离短，流动快；小分子通过多孔凝胶颗粒的内部，具有长距离和缓慢的流动。多孔多糖化合物，如葡聚糖和琼脂糖。(1)凝胶色谱，(3)分离过程，洗脱：从色谱柱的上端连续注入缓冲溶液，促进蛋白质分子的差异流动。(1)凝胶色谱法，1。什么是凝胶？2.什么是凝胶色谱？学生活动2:3。凝胶色谱的原理是什么？请用自己的话总结一下凝胶色谱法分离不同相对分子量蛋白质的具体过程。1.什么是缓冲？2.缓冲的功能是什么？学生活动3:3。如何准备缓冲？关于人的血液，你了解了哪些缓冲物质？4.在这个实验中加入了什么缓冲剂？为什么要添加缓冲？(2)缓冲溶液，由弱酸和相应的强碱和弱酸盐组成。如h2co 3/na2co 3、乙

3、酸/乙酸钠、nah2po 4/na2co 4等。洗脱液组成缓冲液：制备：功能：调节缓冲液的比例，可以制备不同酸碱度的缓冲液。抵御外界酸碱对溶液酸碱度的干扰，保持酸碱度稳定。(2)，缓冲溶液，1，什么是电泳？2.影响电泳迁移速度的因素是什么？学生活动4:4。不同分子的电泳分离原理是什么？(3)电泳；(3)如何消除电荷对电泳迁移速度的影响？请描述一下电泳的过程。2、凝胶电泳：(1)原理：不同的蛋白质在电场中有不同的电荷性质、电量、形状和大小，以及不同的力、方向和电阻，导致不同的蛋白质在电场中有不同的运动方向和速度。影响蛋白质分子运动速度的因素，(3)电泳，1。电泳的概念是指带电粒子在电场作用下的迁

4、移过程，影响蛋白质分子运动速度的因素、在一定的酸碱度下，蛋白质基团带正电荷或负电荷；加入带负电荷的sds形成“蛋白质sds复合物”，使蛋白质的迁移速率仅取决于分子大小。(2)分离方法：(3)分离过程：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。(3)电泳，电泳检测结果，(2)实验操作，蛋白质提取和分离一般分为四个步骤：(1)样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；通过离心分离和其他操作收集血红蛋白溶液。(2)粗分离：透析去除小分子杂质。(3)纯化：用凝胶色谱法除去分子量较大的杂质蛋白。(4)纯度鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳。(1)样品处理；1)红细胞洗涤：目的是去除外来蛋白质。应添加柠檬酸钠以防止血液凝

5、固；离心使血液分层，用橡皮吸管吸出黄色血浆；用生理盐水清洗。2.血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞被破坏并释放出来。3.血红蛋白溶液的分离：离心分层；用滤纸过滤除去脂溶性沉淀层；分液漏斗分离红色透明液体。4.透析：将其放入透析袋中，放入磷酸盐缓冲液(ph 7.0)中进行透析。二、实验操作、跳跃、血液成分、血细胞中的_ _ _ _ _ _细胞数量最多，红细胞含量最高的有机化合物为_ _ _ _ _ _。该化合物由_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _和_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _组成，其中每个亚基含有一个可与o2和co2结合的_ _ _ _ _ _ _ _ _ _

6、_基团。返回，1。洗红色精子细胞，读一读，想一想：洗的目的是什么？洗涤过程：取100毫升血液，重复洗涤3次，直至上清液不呈黄色，收集鸡血，第一次离心后返回结果，第三次洗涤后返回结果，第二次。释放血红蛋白，阅读并思考：在释放血红蛋白的过程中，哪些物质被添加到洗涤过的红细胞中？采取了哪些措施来加快发布过程？目的分析：蒸馏水的作用是_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _。加入甲苯的效果是_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _。充分搅拌的目的是_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

7、_ _。使红血球随水膨胀，溶解红血球的细胞膜，并加速红血球的破裂。(2)释放血红蛋白：在原始血容量中加入蒸馏水，然后加入40体积的甲苯，放在磁力搅拌器上，充分搅拌10分钟(加速细胞破裂)，细胞破裂并释放血红蛋白。磁力搅拌器，返回，3。分离血红蛋白，分离过程，红细胞混合溶液，烧杯，(3)分离血红蛋白溶液，过程：将搅拌的混合溶液转移到离心管中，以2000转/分钟的速度离心10分钟。试管内溶液层：第1层(顶层):甲苯层(无色透明)；第二层(中上层):脂溶性物质沉淀层(白色薄层固体)；第三层(中下层):血红蛋白水溶液层(红色透明液体)；第4层(最低层):杂质沉淀层(深红色)。分离：用滤纸过滤，除去脂溶

8、性沉淀层，在分液漏斗中放置一段时间，分离下层红色透明液体。甲苯层(无色透明)，白色薄层固体，红色透明液体，杂质沉淀层(暗红色)，试管中溶液层，返回，4。血红蛋白透析，透析袋透析，透析过程，返回，纯化凝胶色谱操作，1。凝胶色谱柱的制备。凝胶色谱柱填充，教材图519，3。底部塞的加样和制作：钻孔，挖洞，安装移液管头盖住尼龙网，然后用100目尼龙纱包裹，插入玻璃管的一端。注：插入底塞的玻璃管上部不得超过胶塞凹孔的底面，否则很难铺上尼龙网，导致液体残留和蛋白质分离不完全。顶塞制造：冲压安装玻璃管。组装：根据相应的位置将上述三部分组装成一个整体。安装其他辅助结构。组装凝胶柱，返回，材料：交联葡聚糖凝胶g

9、-75；20毫升/升磷酸盐缓冲液中装有：2.填充凝胶色谱柱：立即用磷酸盐缓冲液洗涤并平衡12小时，洗涤并平衡，然后慢慢倒入一次；轻敲，填充悬浮液，将凝胶颗粒洗脱液浸泡在沸水浴中，用蒸馏水充分溶胀凝胶颗粒，根据柱体积计算凝胶用量，将柱垂直固定在支架上，制备悬浮液，计算并称量凝胶，固定柱，(2)填充凝胶柱，选择凝胶：a .材料：交联葡聚糖凝胶(g-75)。b .代表性含义：“g”表示凝胶的交联度、溶胀度和分离范围。75表示凝胶的产水量，即每克凝胶膨胀时吸收7.5克水。凝胶预处理：凝胶悬浮液的制备：计算取一定量的凝胶，用蒸馏水或洗脱液浸泡，充分溶胀，制成凝胶悬浮液。凝胶色谱柱的包装方法：a、固定：将

10、色谱柱装置固定在支架上。填充：将凝胶悬浮液一次性填充到色谱柱中，填充时轻轻敲击色谱柱，使凝胶填充均匀。注意：1 .尽可能紧密地填充凝胶，以减小凝胶颗粒之间的间隙。2.填充凝胶柱时不能有气泡：气泡会干扰洗脱液中蛋白质的洗脱顺序，降低分离效果。清洗天平：灌装后，立即用缓冲溶液洗脱瓶子，用300毫升20毫升/升磷酸盐缓冲溶液(ph 7.0)在50厘米高的操作压力下清洗瓶子12小时。注意：1 .洗脱水平不应低于凝胶表面，否则可能混入气泡，影响柱内液体的流动和最终生物大分子物质的分离效果。2.不会出现洗脱液流干和凝胶颗粒暴露的现象。返回，3。样品添加和洗脱，调节缓冲液水平：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢

11、下降至与凝胶表面水平，并关闭出口。点滴透析样品：用移液管吸取1毫升样品，加入色谱柱顶部。滴加样品时，移液管的喷嘴靠着管壁移动以添加样品，同时注意不要损坏凝胶表面。样品渗入凝胶层：加入样品后，打开下出口，使样品渗入凝胶层，待样品完全进入凝胶层后，关闭下出口。洗脱：小心加入20毫升/升磷酸盐缓冲液，缓冲液的酸碱度为7.0至适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集：当红色蛋白接近色谱柱底部时，用试管收集流出液，每5毫升收集一个试管，连续收集。(在分离过程中，如果红色区域移动均匀，则色谱柱制造成功。)注：正确的采样操作：1。请勿触摸和损坏凝胶表面。2.将样品贴在墙上。3.使吸管的喷嘴围绕

12、管壁移动。3。样品添加和洗脱、3。样品添加和洗脱。注：加样的正确操作是：1 .请勿触摸和损坏凝胶表面。2.将样品贴在墙上。3.使吸管的喷嘴围绕管壁移动。收集纯化血红蛋白，注意事项，1。红细胞洗涤：洗涤次数不应太少；低速短时间离心。2.凝胶预处理：沸水浴法时间短，可去除微生物和气泡。3.色谱柱的填充：尽可能紧密地填充以减少颗粒间隙；没有泡沫；洗脱液不能被切断。4.色谱柱成功标志：红色区域移动均匀。回去观察你处理的血样在离心后是否分层(见教科书图5-18)。如果分层不明显，这可能是洗涤次数减少和血浆蛋白去除失败的原因。另外，如果离心速度太高，时间太长，白细胞和淋巴细胞会一起沉淀，得不到纯红细胞，这

13、将影响后续血红蛋白提取的纯度。3.实验结果的分析与评价。你处理完血样了吗？你能描述一下处理过的样品发生了什么变化吗？2.您填充的凝胶色谱柱有气泡吗？你的色谱柱包装成功了吗？你怎么判断？由于凝胶是半透明介质，可以在凝胶柱旁边放置一个垂直于凝胶柱的荧光灯，以检查凝胶是否填充均匀。此外，可以加入大分子有色物质，如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，以观察色带的移动。如果色带均匀、窄、平，凝胶色谱柱性能良好。如果色谱柱中有线条或气泡，轻轻敲击色谱柱以消除气泡，如果气泡无法消除，则重新加载色谱柱。如果凝胶色谱柱填充成功，分离操作正确，可以清楚地看到血红蛋白的红色区域均匀、狭窄、平坦，并随着洗脱液缓慢流出；如

14、果红带扭曲、分散、变宽，分离效果不好，这与凝胶色谱柱的填充有关。3.你能观察到蛋白质分离过程中红区的运动吗？请描述红色区域的移动，并根据它判断分离效果。知识总结，血红蛋白提取和分离，教学反馈，1凝胶色谱法是蛋白质分离的有效方法。分子的大小，b相对于分子质量的大小，电荷的数量，以及溶解度2缓冲剂的功能是抵抗外界的影响，保持()在一定范围内基本不变。温度、酸碱度、渗透压、氧浓度、电泳方法血红蛋白b肌红蛋白c肌动蛋白d肌球蛋白，b，a，5血液由血浆和各种血细胞组成，其中()是最丰富的。a白细胞b血小板c红细胞d淋巴细胞6为了防止血液凝固，应事先在采血容器中加入抗凝剂()。氯化钠甲苯蒸馏水柠檬酸钠将搅拌好的混合溶液转移到离心管中。离心后，可以清楚地看到试管中的溶液分为四层，其中第三层是(a)无色透明的甲苯层，b)脂溶性物质的沉淀层，c)血红蛋白的水溶液，d)其他杂质的深红色沉淀，c，1。随着人类进入蛋白质组时代，蛋白质的研究和应用越来越深入。要做的第一步是阐明各种蛋白质的空间结构，阐明各种蛋白质的功能，阐明各种蛋白质的合成过程，获得高纯度的蛋白质，并进行整合。2.描述用凝胶色谱法分离蛋白质过程中的蛋白质。正确的说法是，分子量较小的蛋白质比分子量较大的蛋白质大，分子量较小的蛋白质比分子量较大的蛋白质小，分子