《食品中水苏糖含量的测定——一维核磁共振氢谱法》编制说明

1、 食品中水苏糖含量的测定一维核磁共振氢谱法行业标准编制说明一、 工作简况1、 任务来源根据工业和信息化部办公厅关于印发2018年第三批行业标准制修订和外文版项目计划的通知（工信厅科201854号），食品中水苏糖含量的测定一维核磁共振氢谱法列入行业标准计划项目，项目计划号为2018-1574T-QB，由全国食品发酵标准化中心归口。2、 目的意义水苏糖（Staehyose）是自然界天然存在的一种四糖，广泛分布于豆科及部分唇形科植物中，属于棉子糖属半乳糖苷类非还原性功能性低聚糖。它能显著促进双歧杆菌增殖，成为近年来功能性食品市场上较受欢迎的一种配料。水苏糖对人体胃肠道内的双歧杆菌、乳酸杆菌等有益菌群

2、有着极明显的增殖作用，能迅速改善人体消化道内环境，调节微生态菌群平衡。它能促进形成有益菌在消化道内的优势菌地位，抑制产气产酸梭状芽孢杆菌等腐败菌的生产，另外产生大量生理活性物质，调节肠道pH值、灭杀致病菌，阻遏腐败产物生成，抑制内源致癌物的产生和吸收，并且分解衍生出多重免疫功能因子。目前，水苏糖作为近年保健食品市场上较受欢迎的一种功能原料，产品生产具有一定的规模，目前主要应用于饮料和焙烤食品中。但是由于缺乏食品中水苏糖含量的检测技术方法标准，导致目前市场上某些产品实际添加的水苏糖达不到标签标声称的含量，从而损害了消费者的权益，也严重扰乱了市场，阻碍了水苏糖产业的良性健康发展。现行食品中水苏糖含

3、量的检测主要使用行业标准方法（QB/T 4260-2011），即高效液相色谱法，另外，采用层析法、气相色谱法等方法在特定条件下也能够实现对水苏糖含量的检测。薄层层析法分析时间长、展开剂体积需求大，分离结果差，实验结果准确性、稳定性以及精密度较差；气相色谱法需将糖通过衍生化的方法转换成为可挥发的成分后再测定，过程较为繁琐；高效液相色谱法是较为常用的方法，但其分析时间较长，示差折光检测器的稳定性、重复性和选择性均有一定程度的不足。此外，现行QB/T 4260-2011规定的方法仅适用于以食用植物为原料，经加工提取、精制而成的水苏糖含量进行检测，即P60、P70和P80型水苏糖，对于复杂食品基质中水

4、苏糖的定量分析较为困难，因此，开发一种能够对食品中水苏糖实现快速、准确的定量方法，对于规范水苏糖类产品的市场尤为重要。3、简要编制过程2018年6月-2019年7月标准起草工作组查阅大量国内外核磁共振定量检测技术方法与标准，通过对各方法的原理及特点进行对比分析，选择外标法进行食品中水苏糖含量的测定，对样品的处理方法、水峰压制、检测条件等进行了系统优化，通过稳定性、准确性等一系列了研究，建立了一维核磁共振氢谱法测定食品中水苏糖含量分析方法。 2019年8月-2020年6月本方法经过中国食品发酵工业研究院有限公司、中国医学科学院药物研究所、中国科学院化学研究所、中国科学院武汉物理与数学研究所、天津

5、大学、武汉中科牛津波谱技术有限公司和江南大学7家实验室进行验证，结果符合要求。二、 标准编制原则和主要内容1、 标准编制原则以科学技术和实验数据为依据，经过科学研究而制定。本标准的制定充分考虑水苏糖行业发展需求，促进水苏糖行业提高产品质量，增强企业的市场竞争力，保护消费者权益，确保标准的科学性、先进性、可操作性。2、 主要内容本标准规定了一维核磁共振氢谱法测定食品中水苏糖含量的方法。 本标准适用于水苏糖、片剂、固体饮料及液体食品中水苏糖含量的测定，水苏糖的检出限为50 mg/L。三、 主要试验（或验证）情况分析针对核磁共振波谱技术测定食品中水苏糖含量方法进行了系统研究，详细的研究数据见附件一。

6、（1）方法线性关系：以柠檬酸为定量外标，在0.16.40 g/L浓度范围内，相关系数R2大于0.999，线性关系良好。（2）方法稳定性：日内精密度与日间精密度分别为1.65%与5.27%，说明该方法稳定性符合要求。（3）方法加标回收率：该方法的回收率在95.63%101.28%范围区间，其平均回收率为97.91%，回收率的RSD在2.00%2.32%范围区间，说明该方法精确度较好，能够满足水苏糖的准确测定。（4）方法准确性：本方法经过中国食品发酵工业研究院有限公司、中国医学科学院药物研究所、中国科学院化学研究所和江南大学等7家实验室进行验证，上述测定单位具备良好的分析测试能力，结果真实、可靠，

7、根据实验室GB/T6379.2-2004 测量方法与结果准确度，结果符合验证比对要求。四、 标准中涉及的专利 无五、 产业化情况、推广应用论证和预期达到的经济效果等情况该标准的实施，将解决目前食品中水苏糖含量测定方法标准缺失的问题，对维护消费者利益，促进水苏糖产业持续良性发展具有非常重要的意义。六、 采用国际标准和国外先进标准情况，与国际、国外同类标准水平的对比情况 无七、 与现行相关法律、法规、规章及相关标准，特别是强制性标准的协调性该标准从水苏糖行业的实际情况出发，参考了国内外相关资料，体现了科学性、先进性和可操作性原则，在制定过程中充分考虑国内相关的法规要求，结合水苏糖行业的特点；与相关

8、标准法规标准协调一致。八、 重大分歧意见的处理经过和依据无重大分歧意见。九、 标准性质的建议说明食品中水苏糖含量的测定一维核磁共振氢谱法为推荐性行业标准。十、 贯彻标准的要求和措施建议在本标准通过审核、批准发布之后，由相关部门组织力量对本标准进行宣贯，在行业内进行推广。建议本标准自发布6个月之后开始实施。十一、废止现行相关标准的建议无。十二、其它应予说明的事项无。食品中水苏糖含量的测定一维核磁共振氢谱法行业标准起草组 2020年07月06日3附件 一 食品中水苏糖含量的测定一维核磁共振氢谱法方法学验证1. 研究背景核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）作为一种

9、有机化合物结构解析的代表性分析方法，在1963年首次应用于定量分析，确定了26种纯有机物质中的分子内质子比率。近年来，NMR定量技术已经在药物分析、代谢组学、食品分析鉴别5等领域得到了较为广泛的运用。与气相色谱法、高效液相色谱法等传统分析方法相比，NMR仅需要很少的样品量，便可直接地测定啤酒，果汁，葡萄酒，婴儿配方奶粉等不同食品基质中的多种化合物，而无需预先将复杂混合物中的待测物质分离，具有同时测定被测样品中多种成分含量等优点。水苏糖是由两个-半乳糖，一个葡萄糖和一个果糖构成的四糖，为非还原性功能性低聚糖。具有促进肠道内双歧杆菌繁殖及生长，调节肠道内菌群平衡，增强机体免疫力、降血糖和降血脂等功

10、能。由于水苏糖的物化性质较为稳定，且具有良好的生理功能，通常被添加到食品中，如饮料、米粉、乳制品、口服液等食品中，以适应不同的消费需求。目前食品中水苏糖含量的检测主要使用行业标准方法（QB/T 4260-2011），即高效液相色谱法，另外，采用层析法、气相色谱法等方法在特定条件下也能够实现对水苏糖含量的检测。薄层层析法分析时间长、展开剂体积需求大，分离结果差，实验结果准确性、稳定性以及精密度较差；气相色谱法需将糖通过衍生化的方法转换成为可挥发的成分后再测定，过程较为繁琐；高效液相色谱法是较为常用的方法，但其分析时间较长，示差折光检测器的稳定性、重复性和选择性均有一定程度的不足。此外，现行QB/

11、T 4260-2011规定的方法仅适用于以食用植物为原料，经加工提取、精制而成的水苏糖含量进行检测，即P60、P70和P80型水苏糖，对于复杂食品基质中水苏糖的定量分析较为困难，因此，开发一种能够对食品中水苏糖实现快速、准确的定量方法，对于规范水苏糖类产品的市场尤为重要。基于上述问题，本研究通过引入核磁共振波谱仪，旨在建立一维核磁共振氢谱法，实现对食品中水苏糖含量快速、准确的检测，弥补现行QB/T 4260-2011高效液相色谱法适用范围不足的问题。2 材料与方法2.1 材料与试剂水苏糖标准品（98%），北京百灵威科技有限公司；叠氮化钠（高纯，NaN3），Biotopped；3-（三甲基硅基）

12、氘代丙酸钠（Sodium-3-(trimethylsilyl)propionate-2,2,3,3-d4，TSP，98% ），CIL；磷酸二氢钾（KH2PO4，98%），CIL；重水（D2O，99.9%），青岛腾龙微波科技有限公司；柠檬酸（99%），Vetec；市售含水苏糖的主要食品（样品编号为1-8，其中1号为以草石蚕为原料提取的P70型水苏糖；2号为片剂；3-5号为3种不同品牌的固体饮料，购于某电商平台；6-8号为口服液，购于某超市）。2.2 仪器与设备Bruker Avance III HD 400MHz波谱仪，德国Bruker Biospin公司；Bruker自动进样器(SampleJ

13、et)，德国Bruker Biospin公司；Bruker SampleJet 5 mm高通量核磁管，德国Bruker Biospin公司；涡旋混合器(MX-S)，大龙兴创实验仪器(北京)有限公司。2.3 方法2.3.1缓冲溶液的配制分别准确称取1.00 g TSP和0.13 g NaN3于烧杯中，用D2O将其溶解并定容于10 mL容量瓶中，得到100 g/L的TSP溶液和13 g/L的NaN3溶液。准确称取8.00 g KH2PO4于烧杯中，用100 mL D2O将其溶解并转移至200 mL容量瓶中，向其中加入5 mL磷酸、2 mL上述TSP溶液和2 mL NaN3溶液，以及50 mL D2

14、O。静置24小时后，测定该溶液pH值，若pH 2.0，则加入适量磷酸调整，若pH 0.05），满足测定方法对于精密度的要求。表1柠檬酸作为外标方法日间与日内精密度（n=5）类型水苏糖测定值（gL-1）均值（gL-1）RSD%12345日内1.831.891.831.861.811.851.65日间1.792.001.911.791.771.855.272.5.3回收率实验选取1号样品溶液，向其中分别添加0.78 g/L、1.59 g/L、2.34 g/L、3.20 g/L，4个不同水平的水苏糖标准溶液，单个水平5次重复取均值，结果取平均值，如表2所示。以柠檬酸作为外标，采用PULCON方法测定

15、4个不同的加标水平下，该方法的回收率在95.63%101.28%范围区间，其平均回收率为97.91%，回收率的RSD在2.00%2.32%范围区间，结果表明该水苏糖检测方法精确度较好，能够满足水苏糖的准确测定。表2 柠檬酸作为外标方法回收率水苏糖含量（gL-1）加标量（gL-1）测定值（gL-1）回收率（%）RSD（%）平均回收率（%）1.840.782.63101.282.0097.911.593.3896.862.322.344.1397.862.153.204.9095.632.212.5.4方法对比应用上述已经建立NMR定量方法对市售8个样品的水苏糖含量进行定量测定，每个样品采用1H

16、NMR和2D J-resolved进行检测，重复测定2次，取平均值，结果如表3所示。NMR柠檬酸外标定量结果无显著性差异（P 0.05），NMR定量结果符合样品标签注明的含量；2D J-resolved谱结果显示，H 5.44水苏糖信号峰周围不存在可对其定量结果产生干扰的杂质信号，不影响NMR准确定量，结果表明NMR能够用于水苏糖样品的快速定量检测。采用行标QB/T 4260-2011高效液相色谱法重复测定2次，取平均值，结果如表3所示。1号P70型水苏糖、2号片剂、3号固体饮料和8号口服液样品NMR和高效液相色谱法检测结果基本一致，无显著性差异（P 0.05），进一步表明NMR能够准确定量食

17、品中水苏糖含量；4、5号样品经NMR定量所得结果明显高于行标法和标签注明含量，产生偏差原因可能是样品中其它糖类与水苏糖中葡萄糖基端基质子（H 5.44）信号峰完全重叠；6、7号样品经行标方法检测，未检出水苏糖成分，产生偏差原因考虑主要是由于样品基质中不含有水苏糖成分而是其它糖类在水苏糖中葡萄糖基端基质子（H 5.44）信号峰处产生信号。表3 核磁共振和行标高效液相色谱法定量水苏糖结果水苏糖样品编号样品中水苏糖含量（%）外标(柠檬酸)行标（高效液相色谱法）标签注明含量192.0089.60 70217.4115.53 12.5363.9660.00 60452.6928.72 30540.872

18、7.37 30614.95ND 15717.02ND 10838.1037.56 34注明：% 指单位物质所含水苏糖的重量的百分比；ND表示未检出。为近一步探究4-7号样品NMR定量结果与行标方法产生差异的原因，以水苏糖的半乳糖端基质子（H 5.00）信号作为定量峰对样品中水苏糖含量进行计算。结果如表4所示。1-3号和8号样品定量结果与以葡萄糖端基质子作为定量峰时结果一致，无显著性差异（P 0.05）。4、5号样品定量结果更接近于行标法测定的水苏糖含量。而6、7号样品在H 5.00处未出现质子特征信号，则认为6、7号样品中不含水苏糖。根据4、5号样品配料表所注明成分，对其分别添加葡萄糖、果糖、

19、半乳糖和低聚果糖进行加标实验，发现添加低聚果糖的4、5号样品，其H 5.44质子信号积分面积显著增加，由此造成以H 5.44质子信号作为定量峰时，水苏糖定量结果偏高，故H5.44定量峰不适用于含低聚果糖的食品基质。表4 以半乳糖端基质子信号作为定量峰的水苏糖核磁共振定量结果水苏糖样品编号样品中水苏糖含量（%）189.26216.24363.78430.33530.136ND7ND838.45注明：% 指单位物质所含水苏糖的重量的百分比；ND表示未检出。3 结论本研究以柠檬酸作为定量外标，建立了食品中水苏糖NMR定量分析检测方法。以葡萄糖端基质子（H 5.44）信号作为定量峰，该方法在0.0256.40 g/L浓度范围内线性良好，相关系数大于0.999；以柠檬酸作为外标方法加标回收率为97.91%，日内精密度与日间精密度分别为1.65%与5.27%；对于基质中含有低聚果糖的食品，采用半乳糖端基质子（H 5.00）信号作为定量峰对水苏糖含量进行计算。该方法具有很好的重复性和稳定性。与现行行业标准方法相比，NMR法前处理操作简便，实验过程中避免