《甘蔗感染黑穗病的鉴定方法 PCR 法》征求意见稿

1、ICS65.020.20B 16DB45广西壮族自治区地方标准DB 45/T 甘蔗感染黑穗病的鉴定方法 PCR 法点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（本稿完成日期：） - - 发布 - - 实施广西壮族自治区市场监督管理局 发布DB 45/T 目次前言21范围32规范性引用文件33术语和定义34方法原理35仪器36试剂37引物38操作步骤39试验成立的条件410结果判定4附录A（资料性附录）样品检测电泳图6前言本标准根据GB/T 1.1-2009给出的规则编写。本标准由广西壮族自治区分析测试研究中心提出并宣贯。本标准由归口。本标准起草单位：广西益谱检测技术有限公司、广西壮族自治区分析测试研

2、究中心、广西博测检测技术服务有限公司。本标准主要起草人： 。甘蔗感染黑穗病的鉴定方法 PCR 法1 范围本标准规定了甘蔗黑穗病菌的PCR快速检测方法。本方法适用于甘蔗组培苗、苗圃种苗及大田植株黑穗病菌的测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义3.1 甘蔗黑穗病原菌甘蔗黑穗病病原菌为担子菌亚门孢堆黑粉菌属甘蔗鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum）。4 方法原理应用聚合酶链反应（

3、Polymerase Chain Reaction,PCR）检测技术对甘蔗黑穗病原菌DNA进行体外扩增，可得到快速、有效的鉴定结果。5 仪器高速冷冻离心机、水浴锅、PCR仪、水平电泳装置、凝胶成像系统。6 试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯（含）以上试剂或生化试剂，实验室用水应符合GB/T 6682。所用试剂：十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、Tris、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、氯化钠、氯仿、无水乙醇、TE溶液、琼脂糖、硼酸、DNA相对分子质量标记、CTAB缓冲液（CATB 4 g，NaCl 16.38 g，Tris 1.21 g，EDTA1.49 g，先用70 mlddH2O溶

4、解，再定容至200 ml灭菌）、5TBE溶液（Tris 5.4 g，EDTA 0.372 g,硼酸2.75 g，先用70 mlddH2O溶解，再定容至100 ml灭菌）。7 引物正向引物bE4：5-CGCTCTGGTTCATCAACG-3，反向引物bE8：5-TGCTGTCGATGGAAGGTGT-3，预期扩增片段大小为420bp。8 操作步骤取100 mg样品于研钵中，加入液氮研磨成粉末状，装入2 ml离心管中，加入750 LCTAB于样品管中，65水浴45 min，隔15 min轻微颠倒混匀，加500 L氯仿，颠倒混匀，12 000 r/min，离心3 min，吸上清500 L到新的离心管

5、中，加等量冰冻过的无水乙醇，在冰箱冷冻8 min，12 000 r/min，离心3 min，倒掉上清，放在纸上晾干，加超纯水溶解。8.1 PCR扩增反应8.1.1 PCR反应体系PCR反应体系见表1。表1 PCR反应体系试剂体积水1L2Es TaqMasterMix5L10M正向引物1.0L10M反向引物1.0LDNA模板2.0L总体积10.0L8.1.2 PCR扩增程序预变性94，4min；35次循环94变性30s，55退火30s，72延伸1min；延伸反应72，10min。8.2 扩增产物的电泳检测将适量的琼脂糖加入0.5TBE缓冲液中，加热将其溶解，配制成琼脂糖浓度为1的溶液，然后按每1

6、00ml琼脂糖溶液中加入5lGel-Red核酸染料的比例，混匀，稍适冷却后，将其倒在电泳板上，室温下凝固成凝胶后，放入0.5TBE缓冲液中。在每个泳道中加入2.5l的PCR产物（需和上样缓冲液混合），其中一个泳道加入DNA分子量标记，接通电源进行电泳。8.3 凝胶成像分析电泳结束后，将琼脂糖凝胶电泳置于凝胶成像系统成像仪上或紫外透射仪上成像，根据DNA分子量标记判断扩增出的目的条带的大小，并将电泳结果用照相系统拍照，根据有无特异扩增带（420bp）检测样品有无甘蔗黑穗病菌。9 试验成立的条件以水为空白对照，以感染甘蔗黑穗病的病株为阳性对照，以甘蔗无病种苗基因组DNA为阴性对照。阳性对照的扩增产物经电泳检测，在预期大小的条带位置均出现特异性条带，阴性对照的扩增产物经电泳检测均没有预期大小的目的条带。阴、阳性对照同时成立则表明试验有效，否则试验无效。10 结果判定10.1 阳性判定如果阳性对照和检测样品中同时出现目的扩增条带，而阴性对照、空白对照均不出现该条带，该样品判为阳性；10.2 阴性判定如果阳性对照出现目的扩增条带，而阴性对照、空白对照及检测样品中均不出现该条带，则该样品