5 DNA序列分析

1、第五章DNA序列分析，DNA序列分析有两种茄子基本方法：Maxam-Gilbert化学分解法和Sanger酶法。对每个反应读取的序列进行排序是有限的，因此，破译长DNA或基因组序列时，必须使用一定的策略。排序的策略包括primer walking、随机排序、方向排序等。现在全自动排序仍然使用Sanger酶法，但在标记上有所改进。DNA测序结果通过生物信息学分析获得所需信息。5.1 Maxam-Gilbert化学分解法，1977年，A.M. Maxam和W. Gilbert首先建立了DNA片段的5段磷酸基作为放射性标记，然后分别用不同的化学方法修饰特定碱基，测定DNA片段序列的方法。这会产生长度

2、不同、标记为5段的DNA片段。以特定碱基结束的片段通过凝胶电泳分离，通过辐射自身现象确定每个片段的末端碱基，得出目的DNA碱基序列。化学分解测序的基本阶段，硫酸二甲基酯(CH3O)2SO2是碱性化学试剂，能在DNA链中制造腺嘌呤A的N2和鸟嘌呤G的N甲基化，但鸟氨酸G的N甲基化速度比腺嘌呤A的N2甲基化速度快4-10倍，在中性pH环境中，DMS主要是鸟嘌呤甲酸，在DNA链中的嘌呤是酸的作用下肼(肼NH2 .(也称为NH2)在碱性环境中作用于细胞素C和胸腺T的C4和C6位置，导致糖苷结合中断。如果放入高浓度的盐(1.2米NaOH)，肼主要作用于细胞色素C，导致断裂。化学改性剂，Maxam-Gil

3、bert化学分解法序列分析常用的化学试剂，ACGT C，化学分解分析法应用，Maxam-Gilbert化学分解分析法不需要酶催化反应，不会因酶催化反应而产生误差。化学分解分析法特别适合于测定包含5-甲基腺嘌呤A或G C含量高的DNA片段、短链的过核苷酸片段的序列。Maxam-Gilbert化学分解分析法的碱基测序长度约为250个碱基。5.2 Sanger脱氧链终止法，脱氧核苷酸分子脱氧核糖3位置的-OH缺失。当它在与其他正常核苷酸相同的扩增反应系统中混合时，在DNA多胺的作用下，可以像正常核苷酸一样参与DNA合成，但可以结合5个位置的磷酸基和上脱氧核糖核苷酸的3个位置-OH，但由于自身的3个位

4、置-OH不足，下核苷酸的5个磷酸基不能结合。、p、oh、o、h、dNTP、DNA链不能正常扩展，Tm值约为55-60。避免哈芬和迪默。反应阶段模板变性退火标记扩展传记电泳和数据读取，3 agctcgtagcatgcatgctagcat 5，template，ddatp，datp，dctp，dgtp，dttp，ga * GCA * Tcgta通过像PCR这样的热循环反应过程，可以多次重复这种反应。产物的数量不是金志洙放大，而是线性放大。自动测序的核心技术是不使用同位素标记，用4茄子其他罗丹明荧光染料分别标记4茄子脱氧核苷酸。毛细管传记电泳按照1核苷酸大小的DNA片段顺序向下游，到达探测器后，激光

5、探测器会发射激光，刺激4茄子荧光。DNA序列分析器377型、5.3 DNA片段序列测定战略、Sanger双脱氧核糖终止法是测定DNA序列所需DNA序列所需的寡核苷酸链引物。因此，对于未知序列的DNA片段，选择合适序列的引物是排序的前提。一次排序提供了800个以下的核苷酸，因此对于较长的DNA片段，必须采取一定的策略才能有效地测量所有序列。通用引物引导未知序列的测量，将未知序列装入质粒传递体，并利用传递体的已知序列设计引物。引物Walking，引物顺序推进法从目标段的一端开始，利用载体的顺序设计第一反应的反应引物，对序列进行解密，然后根据之前的排序结果设计下一反应引物，逐步解密，直到完成。(阿尔

6、伯特爱因斯坦，Northern Exposure(美国电视电视剧)，成功)引物依次推进法，多次需要设计和合成引物，比较麻烦。对于重复序列多的目的DNA，讲义的非特异性结合概率高，所以牙齿方法不适合测定重复序列多的DNA片段。随机复制排序随机克隆，随机复制排序的应用范围如何计算？公式：Sn=1-(1-/L)n Sn:复盖范围L:目标DNA长度：每次读取时需要长度n:排序次数示例：l=5，500，000，Sn面对日益增长的基因数据库，需要这些数据为了适应这种要求，人们将信息学的概念应用于基因数据库分析。庞大的基因组数据经过有效的整理和分析，反而促进了碱基测序工作和生物学研究的发展。序列分析及生物信息学的应用，基因序列的信息分析，获得DNA的核苷酸序列后，可以进行多种初步分析。例如，开放阅读箱的分析和查找、外显子的预测、分析启动子和增强子序列及其他控制序列、在公共遗传数据库库中查找相似序列、对两个或多个相似序列的相似性比较等。根据RNA结构分析DNA核苷酸序列，可以在RNA的二次结构预测、折叠数计算等相应RNA水平进行分析。蛋白质序列的信息分析可以根据核酸的序列信息诱导蛋白质序列，预测蛋白质的二次、三次结构，从而预测