凝固酶阴性葡萄球菌

1、凝固酶阴性葡萄球菌致病性分子标记的建立及应用。据该基金会称，凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)广泛存在于人类皮肤、粘膜和其他组织的表面，并经常在血液、痰液、尿液、深静脉导管插入术和其他标本中检测到。文献报道，从1995年到1996年，美国48个医疗中心的2596份血样中CoNS的分离率为32.2%。尽管从无菌体液如血液中培养CoNS具有重要的临床意义，但据报道，在单一血液培养物中CoNS污染的可能性仍然高达85%。近年来，CoNS已成为医院感染的重要病原体，耐药菌株比金黄色葡萄球菌更常见。叶联华报道，人工瓣膜手术后约40%-50%的心内膜炎是由凝固酶阴性葡萄球菌引起的。2009年，耐甲氧西林金黄色

2、葡萄球菌的平均检出率为71.7%，高于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的52.7%。研究背景和意义。CONS作为一种皮肤粘膜定植菌，已经从越来越多的标本中分离出来，这往往会引起临床上的困惑。它是否能被用作感染的病原菌是一个临床问题。鉴于此，实验室有必要建立一种方法来界定CoNS污染菌和致病菌，这是临床诊断和合理治疗方案的重要前提。研究背景和意义，4、CoNS致病物质，在CoNS感染的发病机制中，最重要的致病机制是细菌先粘附后形成生物膜，这是很难去除的；其中，CoNS产生的多糖细胞间粘附(PIA)是细菌生物膜形成和聚集阶段的必需物质，在感染过程中发挥重要作用，是鉴定其致病性的物质基础。Heilmann等

3、人发现ica操纵子在细菌合成PIA和形成成熟生物膜中起着非常重要的作用。研究背景和意义，5。ica基因结构，ICA基因座位于细菌染色体上，总长度为3.4 kb，包括icaR调控基因和icaA、icaD、icaB和icaC结构基因串联存在。其中，icaADBC四个基因组成一个操纵子，通过检测ica ADBC基因可以反映ICA操纵子的存在。IcaB不直接参与细胞间粘附素的合成，因为重组细胞间粘附素能积累细胞；IcaA单独显示低的n-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性；廉政公署涉及运输连续合成的多糖到细胞表面。生物膜的形成需要icaD编码的产物具有最佳活性。因此，我们选择icaD作为本实验的靶基因片段。6、获

4、得CoNS特异性致病分子标记；建立敏感、准确、快速的医院感染相关CoNS特异性基因诊断方法；能够准确识别致病性和非致病性CoNS。研究背景和意义。实验目的。研究CoNS的生物标志物，用于医院获得性感染细菌的临床微生物学诊断和鉴定，追踪传染源，探索其在医院感染、传播和感染规律中的确切作用和地位，对控制传播途径和制定准确有效的防控措施具有重要的现实意义和经济价值。研究背景和意义，3，临床意义，8，阴性对照：表皮葡萄球菌ATCC12228，购自中国药品检验所，其ica操纵子被基因组测序删除；阳性对照：瑞金医院倪宇星教授赠送的表皮葡萄球菌1-97-337，含有完整的ica操纵子；待检样本：2006年1

5、月至2007年9月，我院各临床科室共采集疑似传染病样本114份。第二部分材料和方法：1 .科目：9。主要试剂：哥伦比亚琼脂培养基、刚果红琼脂培养基和LB肉汤增菌液。引物：SodA引物(5-CCITYACITAY GAYCIYTIGARCC-3和5-ARTAI GCRTY TCCCAIRTC-3)；IcaD引物(5-AGGCAATA TCCAGAGGTAA-3和5-GTCAGACTTTATTAT-3)；16S rDNA引物(5-AGAGGTTTATCCTGGCTCAG-3和5-CCGTCAATTCATTRAG TTT-3)。材料与方法，10，3，主要仪器设备，聚合酶链反应仪：PTC100聚合酶链

6、反应仪，MJ研究公司；美国；恒压恒流电泳仪及电泳槽：东风-C型，北京东方特利科贸中心；凝胶成像系统：UVP公司GDS8000，美国；核酸/蛋白质量词：DU640，贝克曼；美国；酶标仪：美国热毒，深圳组装；ATB表达式：bioMrieux公司；法国；生物安全柜：B2 BSC-1500，济南新北西生物技术有限公司；自动快速微生物培养检测系统：BacT/ALERT 3D 60，bioMrieux公司；法国；材料和方法，11，4，实验设计和方法，标本采集，阴性和阳性对照，菌株鉴定，PIA检测，聚合酶链反应扩增，icaD基因，sodA基因，16SrDNA序列，生物膜形成实验，DNA测序，生物信息学分析，

7、图2.1:部分样品的刚果红试验结果，3，4，1，刚果红试验，第三部分结果及讨论，13，表2.13360，114株CoNS及刚果红试验结果，结果及讨论，14，刚果红试验通过培养48小时后菌落颜色的变化反映CoNS表达的多糖细胞间粘附，进而间接反映其致病性。刚果红试验在114份样品中的阳性率为21.1%，由于CoNS分泌的PIA在培养过程中会丢失，阳性率较低；此外，其方法本身很容易受到许多因素的影响，如蔗糖的浓度、氯化钠和琼脂的浓度、气体条件等。干扰了实验结果的正确性，不能满足临床要求。结果与讨论，15，2，ica D基因片段的扩增，图2.2:部分样品icaD基因片段的聚合酶链反应扩增结果，结果与

8、讨论，16，表2.2:114个CoNS不同菌株icaD片段的聚合酶链反应扩增结果，结果与讨论，17，结果与讨论，18，部分样品的定性粘附实验结果。3.体外粘附实验，结果与讨论，19，表2.4 :半定量粘附实验结果9个icaD()菌株，结果与讨论，20，通过体外半定量粘附实验，88.9%(8/9)icaD()菌株为粘附菌株。可见，半定量粘附试验的结果可作为生物膜形成能力的标准，ica操纵子的存在与CoNS粘附和生物膜形成密切相关。体外粘附实验利用光吸收原理检测生物膜的成分，但生物膜本身的结构会被破坏；由于方法的复杂性，需要严格控制实验条件以获得较好的重复性，这不适合常规临床应用。结果和讨论，21

9、，4，16S rDNA和sodA基因片段扩增，图2.5:一些样品的16S rDNA片段的聚合酶链反应扩增结果，结果和讨论，图2.6:一些样品的sodA片段的聚合酶链反应扩增结果，结果和讨论，23，图7:一些样品的sodA聚合酶链反应扩增产物的测序图，结果和讨论，24，在37个CoNS样品中进行16S rDNA基因和sodA基因片段的聚合酶链反应扩增。电泳结果表明，所有样品都能准确扩增出相应的片段，分别为16S rDNA 926bp和sodA 482bp，为单条带。测序表明，16S rDNA和超氧化物歧化酶A的聚合酶链反应产物在所有样品中均相同，未发现与感染相关的特异性分子序列。结果与讨论，25。ICA操纵子可以出现在多种CoNS中，因此临床实验室建立和常规检测CoNS的致病分子标记是有意义和必要的；通过本实验，我们建立了一种灵敏、准确、快速诊断医院感染相关CoNS基因的新方法，即ica D基因扩增法；结论，第四部分，26，结论，本研究首次报道了凝固酶阴性葡萄球菌而非表皮葡萄球菌产生多糖细胞间粘附因子；表皮葡萄球菌是携带icaD操纵子的主要