荧光定量PCR实验数据分析.ppt

1、荧光定量PCR实验数据分析与常见问题解决,技术支持 黄志,内 容,Life Technologies 公司定量PCR仪产品概览 荧光定量PCR实验数据分析 荧光定量PCR实验常见问题的解决,AB荧光定量PCR仪的发展历史,1995世界上第一台定量PCR仪-7700型诞生 1997推出面向医疗系统用户的5700型定量PCR仪 2000推出7900型384孔定量PCR仪 2001推出7900型96孔定量PCR仪 2001推出7000型96孔定量PCR仪 2004获得定量PCR仪专利确立AB在业界内的领先地位 2004第5代定量PCR仪73007500型诞生 第6代定量PCR仪StepOne和Ste

2、pOne Plus问世 第7代定量PCR仪ViiA 7发布 最新荧光定量PCR仪 QuantStudio 12K Flex 发布,AB荧光定量PCR仪家族,第一、二代 7700 5700,第三、四代 7000 7900,第五代 7300 7500,第六代 stepone /plus,第七代 ViiA 7,最新型 QuantStudio,荧光定量PCR实验数据分析,荧光PCR实验结果的分析流程,查验扩增曲线,检查 / 调整基线,检查 / 调整阈值,检查 NTC,检查 阳性对照,检查阴性对照,分析 样品数据,基线与阈值线的设置,一般情况下选择软件默认的“自动设置”； 特殊情况下或必要时，可以手动设

3、置； 手动设置的原则请查询“Data Analysis on the ABI PRISM 7700 Sequence Detection System: Setting Baselines and Thresholds: Guide: Rev A ”，文件号： 4370923 。,基线的设定,系统背景信号，在扣除背景过程中影响扩增信号的数值，最终影响Ct值。 默认自动分析，比如设定在“3-15”个循环。 手动设置时要避开前期的荧光波动与后期的扩增信号。 必要时可以独立设定制定样品的基线取值范围（V2.0）。,阈值线的设定,默认设定为同类扩增基线信号标准差的10倍，反映扩增信号具有统计学显著的意

4、义。不同扩增子应当独立设定阈值线。 手动设置在“指数扩增期”，避开前期的背景荧光波动与后期的非指数扩增及阴性对照最高点。 对于绝对定量实验，阈值线设定在使得标准曲线的决定系数值（R2）接近1，斜率接近-3.32的地方。 对于无标准曲线的实验，阈值线设定在使得重复样品Ct值差异最小的位置。 阈值线设定在保障灵敏度均为最佳的位置,实验结果的考评指标,定性实验： 是否为显著的“S型”扩增曲线 扩增曲线的“高度”-表示体现扩增性能的“强度” 阳性对照的Ct值是否在“预期”的位置 ： 过早污染或加样错误 过晚存在抑制剂或扩增体系条件不佳 阴性对照是否报告Ct值 污染、探针特异性差、阈值线设定过低,绝对定

5、量实验： 标准曲线的斜率或扩增效率 标准曲线的决定系数值：R2 检测样品是否偏离标准曲线 重复样品Ct值的标准差,绝对定量实验效果的评估,CT = k lg X0 + b,CT2 CT1= （k lg X02 + b） （k lg X01 + b）,CT2 CT1= k (lg X02 lg X01 ),CT2 CT1= k lg (X02 /X01 ),当扩增效率为100时，K=-3.32， 若C T相差1，则两个样品的浓度差异为：,lg (X02 /X01 )= (CT2 CT1)/k,当扩增效率为100时，K=-3.32， 两个样品的浓度差异为10倍，则C T 差异为：,CT值差与模板量

6、差的关系,浓度增加1倍，CT值减小1个单位,浓度增加10倍，CT值减小3.3个单位,荧光定量PCR实验常见问题,病原体核酸检测效果的主要影响因素,样品采集和储运,核酸抽提,核酸定量检测,采样部位、保存液、冻融,导致巨大差别的因素,导致一般差别的因素,交叉污染、抑制剂、病毒裂解,引物、探针设计/合成质量 核酸的纯度和完整性 预混液的质量,样品量,样品量、回收率,仪器、循环条件,实验污染 反应试剂质量问题 未正确密封而导致的试剂蒸发 错误的荧光染料设置 错误的反应程序设置 使用错误的耗材 荧光污染 仪器硬件问题,导致异常实验数据的常见原因:,两种容易混淆的阴性对照,无模板的阴性对照 在反应体系中不

7、加入核酸模板，而以水为替代的对照 目的：监控配制反应体系的试剂是否存在污染。 阴性样品的对照 在样品制备过程中，加入已知的阴性样品（或水），并将提取物作为模板加入反应体系，参与整个实验过程。 目的：监控整个实验操作过程中是否存在污染。,故障排除时提供有用信息的软件界面,原始荧光组分曲线-v2.0,扩增曲线-v2.0,标准曲线-v2.0,原始多通道荧光信号-v2.0,原始多通道荧光信号-v2.0,质控报告-V2.0,理想的实验结果,案例1:是否存在扩增？,一些形状和正常的扩增曲线有区别的曲线，该如何判断呢？,正常的扩增曲线,平台期很低,可疑的扩增曲线,这些曲线都有典型的指数增长期，而且和其他的曲

8、线平行（虽然比较短）。,如何判断它们是真正的扩增？,同时也具有特征性的三个增长阶段。,如何判断它们是真正的扩增？,可能是目标模板的浓度太低。 通常如果模板的起始浓度太低, 反应体系会形成大量的引物二聚体。 大量引物二聚体的形成使得引物很快消耗完，从而造成扩增曲线的平台期很低。,是什么原因造成平台期很低?,案例2:是否存在扩增？,?,如何判断它们是否存在扩增？,首先，和同一反应中的其他扩增曲线相比，这些曲线的形状不相同。,同时，这些曲线都没有明显的指数增长期。,如何判断它们是否存在扩增？,其次，看Y轴的数值。 这些“可疑”曲线的指数增长期范围常常是落在1e-2 的范围内。,对数图,如何判断它们是

9、否存在扩增？,最后，查阅线性图： 曲线一直没有指数上升的趋势，提示不存在扩增。 轻微的荧光增长可能来源于探针的降解。,如何判断它们是否存在扩增？,案例3:是否存在扩增？,右侧的曲线形状和扩增曲线很相似，但是曲线不光滑。,切换到线性图，可以看到曲线有一定的上升。,如何判断它们是否存在扩增？,分析,这些样品在反应的最后阶段才开始扩增，平台期很接近背景。 这些样品的扩增曲线出现了指数扩增的区段 虽然我们可以认为这些样品是临界阳性，但是对这些样品的定量结果都是不太准确的。 形成这类曲线的原因可能是模板的质量差 (RT / PCR抑制物; 模板浓度低)， 也可能是引物探针的设计问题。 试剂原因 如果使用的试剂背景信号太强，荧光的增长将会很小，导致扩增曲线的指数增长期会变得很短，或者没有。 荧光信号差的试剂也会有同样的问题。,总结：遵循扩增曲线形态第一，Ct值第二的判读原则。,查看MultiComponent Plot：是否有正常的阳性扩增曲线 查看扩增曲线的形状：是否有明显扩增阶段（指数增长期）? 指数图下扩增曲线间是否