流式细胞术在出血与血栓性疾病中的应用

1、流式细胞仪(flow cytometer，FCM )在出血和血栓性疾病中的应用，安徽省立医院血液科吴竞生，FCM在出血和血栓性疾病中的应用，集成激光、电子物理、光电测量、计算机、细胞球荧光化学和单克隆抗体的新技术。 对高速直线流化态中的细胞球或生物粒子进行快速、灵敏、多残奥仪量化分析及筛选技术。 开辟了通向单一BPC或亚群分析的新途径。 FCM分析BPC的主要项目工程，血小板计数： CD41，CD61滑道组织血小板(RNA噻唑橙染料) :含有RNA的BPC自身抗体：特异性血小板抗体，PAIg，同种抗体免疫显性性状分析：膜糖蛋白表达： GPIb/IX/V复合物(cd42a ) cd61 IIIa

2、 BPC激活：膜糖蛋白表达(p选择素，CD62p) BPC内物质，微粒子对不同刺激剂的反应性：细胞质钙元素流、FCM在出血性疾病中的应用1 .血小板减少：血小板数量、网状血小板2、血小板功能不全血小板无力症： GPIIb-IIIa(CD41- CD61 ) 巨大血小板综合征： GPIb-IX(CD42b-D42a 3，血小板抗体：监测储藏和输液，出血性疾病分类血管壁功能异常遗传性(毛细血管扩张症，家族单纯性)获得性(变态反应性紫癜，血管炎，免疫性)数量遗传性，获得性Aa，巨核，免疫性，ITP，DIC血小板异常数量(ET，CML 功能异常(GT、BS、颗粒性)凝血功能故障遗传性(血友病、VWD、

3、其他凝血因子缺乏)获得性(VK缺乏、肝病、DIC、药物)循环中病理性抗凝血物质凝血因子阻碍物质肝素样抗凝血物质； 环路样抗凝血物血纤蛋白(原)溶解亢进遗传(t-PA/u-PA抗线溶酶催化剂)获得(DIC，血栓形成)、血小板订正数、BPC直径14m、RBC、WBC或FCM的优点：利用各种BPC专一性单克隆抗体直接标识牌萤光素分子，排除非BPC粒子干扰作用，误差为5% FCM分析血小板的原理，利用萤光素标识牌的BPC专一性单抗或与被测成分特异性结合而发出荧光的物质，分离BPC或全血，除去未反应的单抗或荧光物质。 对5000-10000 BPC的光散射和荧光信号(单色或多色)进行特异性检测，根据取得

4、、统一校正数据、分析、光散射和荧光强弱来校正阳性BPC或测定成分的含量(GP/BPC )，FCM分析血小板方法，抗凝血2ul调节BPC 105-106/ml 2-80C 检测2h BPC特异性单抗荧光剂(异硫氰酸萤光素) (CD42b FITC) SSC FSC定径套男同性恋特异性选择bpc.10000-100000bpc表面荧光信号. FCM取得，分析数据结果为表示：平均粒子荧光强度-活性化时：的血小板光散射图， FCM分析血小板的客观评价，利用各种BPC专一性单克隆抗体直接标识牌萤光素分子的优点有： 1、接近大姨妈条件的直接血小板： 2、微量(2ul) 3、快速准确测定，排除非BPC颗粒干

5、扰作用，误差5%，主观因素少，灵敏度高(血管壁、剪切力、刺激)2、不能反映与血管壁的相互作用、血小板功能缺陷粘连异常巨大血小板综合征GP1b-FX血管性血友病(vWD) vWF量、质异血小板型vWD GPIIb-FIX自发结合vWF凝聚异常血小板无力症GPIIb-IIIa缺乏颗粒异常灰色血小板综合征颗粒贮存异常或成分缺乏贮存池病， 致密体颗粒缺乏接纳体和细胞信号异常环氧酶缺乏症环氧酶缺乏症合成酶催化剂缺乏细胞信号缺陷症花生四烯酸油脂不能调动膜磷脂复合物异常，血小板膜糖蛋白分析、GP受体是血小板功能的基础，会引起分子结构或数量异常、出血或血栓。 GPIIb/IIIa复合体(CD41/CD61)

6、GP Ib/IX/V复合体(CD42a/CD42d) GPIa/IIa复合体(cd49b/cd29)gpic之一是检测抗体。 FCM分析血小板膜糖蛋白，在荧光标识牌的抗BPC糖蛋白抗体(McAb) GP特异性结合FCM上检测结合萤光素的阳性BPC%和强度。 直接法和标识牌二抗间接法具有灵敏度高、可测量的BPC上微弱荧光强度的优点。 专一性强的： FS SS和其他细胞球、东鳞西爪的区别精度高的：数万BPC显示结果：%强度操作：简单、迅速。 双色荧光分析血小板膜糖蛋白、血小板分化抗原及其单抗、FCM分析血小板膜糖蛋白的临床应用、遗传性血小板功能缺陷：粘附功能缺陷：巨血小板综合征(GPIb/IX/V

7、复合物缺陷)聚集功能缺陷：血小板无力症(GPIIb/IIIa复合物缺陷)激活血小板是Annexin V/FV/不能与Va结合，FX/Xa获得性血小板功能缺陷：在肝脏、肾脏病、药物(ASA )、gpiibiiia、BPC活化gpiibiiia中直接检测Fg接纳体暴露gpiiiia的1，GPIIb-IIIa- GT 2， 间接结合到BPC表面的Fg :检测GPIIb-IIIa结合到FCM云同步上的Fg: GPIIb-IIIa量正常Fg结合能力GPIIb-IIIa质异常-变异性，根据结合率判断纯合体和杂合子的状态。 血小板无力(GT )，1918年瑞士Glanzmann报道了BPC膜gpB-ia缺乏

8、或质量缺陷，BPC激活后未能与BPC黏附蛋白(Fg，vWF) BPC聚集功能故障结合。 诊断：血小板正常，分布中散布的出血时间延长的各种混凝剂聚集或大幅度降低的重症BPC中没有Fg。 确诊： gpb -ia缺乏或减少(FCM )治疗：注射BPC。 DDAVP； rFVIIa，病例1，血小板无力(GT )，患者，男，17岁，自幼反复鼻出血、牙龈出血，黑便2天。 父母近亲结婚，家族中无类似病史。 查体：重度贫血貌，皮肤可见老磨斑，佝偻正常。 实验室检查： BPC 84X109，血小板形态正常PT12.3”，KPTT35”，vWF105%，BT 12，ADP诱导不集成，Ristocetin诱导集成正

9、常，gpiib/iiia(cd44血小板无力膜糖蛋白分析荧光散点图，巨血小板综合征(bernana GPIb/IX/V复合体量和质缺陷，BPC不能与vWF结合，粘接功能降低。 实验室：出血时间延长、BPC减少、巨大BPC、BPC寿命缩短、Ristocetin以外，其他混凝剂反应正常GPIb (聚丙烯酰胺凝胶阳离子电泳)诊断： GPIb(CD42b-CD42a) FCM治疗： 荧光法：荧光染料盐酸阿地平标识牌BPC，显微镜观察。FCM :致密颗粒直接测定，包括血小板自抗体测定，对人组织相容性抗原的抗体：血小板表面相关抗体(PAIgG )血小板膜糖蛋白抗体： GPIIb/IIIa、血小板专一性抗体和ITP、ITP :血小板专一性抗体介导的血小板破坏增高机制(2) 抗原抗体复合物激活补体C1q及各成分，C3b附着于血小板表面，与宏命令噬菌体C3b接纳体结合，吞噬血小板(3)巨核细胞球具有与血小板相同的抗原性，血小板抗