特异性抗原抗体的应用及展望

1、特异性抗原抗体的应用及展望 院系：生物工程 专业：生物技术 姓名：邵明洋 学号： 特异性抗原抗体的应用及展望 摘要 抗原的特异性是物质之间相互吻合性或针对性、专一性。抗原的特异性表现在免疫原性和抗原性两方面。抗原结合价是一个抗原分子能与相应抗体分子结合的功能性抗原决定基的总数。所以一种抗原只能消灭一类细菌或病毒。特异性抗原抗体的作用具有特异性、比例性、可逆性。可应用于抗体血清的制备、单克隆抗体制备、人单克隆抗体的制备、基因工程抗体的制备、催化性抗体的制备、中药的提取和应用、抗体特异性分布的治疗和诊断使用 关键词：特异性抗体、免疫、单克隆抗体、抗体制备 引言：抗体和抗原的特异性结合是免疫的重要部

2、分，也是具有较强发展潜力的课题。许多的药物生产和疾病的治疗都依赖于他的成熟发展和新成果的获得。抗原抗体反应的过程是经过一系列的化学和物理变化，包括抗原抗体特异性结合和非特异性促凝聚两个阶段，以及由亲水胶体转为疏水胶体的变化。根据其原理进行新的开发与利用是当前主要研究手段。1、 特异性抗原抗体的结构 独特性抗体是指不同特异性Ig分子的V区和T、B细胞表面的抗原（识别）受体（TCR和BCR）V区所具有的抗原特异性标记，其特异性由Ig高变区的氨基酸序列和构型决定。由于每一个B细胞克隆所产生的Ig分子均具有不同于其他Ig分子的HVR结构，因此Ig独特型抗原表位的数目十分庞大。简而言之，该抗体可以与另一

3、种抗体的V区结合。 抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链（H链）；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链（L链）。链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子。轻链有和两种，重链有、和五种。 整个抗体分子可分为恒定区和可变区两部分。在给定的物种中，不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。可变区位于Y的两臂末端。在可变区内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈，这些氨基酸的残基组成和排列顺序更易发生变异区域称高变区。高变区位于分子表面，最多由17个氨基酸残基构成，少则只有2 3个。高变区氨基酸序列决定了该抗体结合抗原抗原的特异性。一个抗

4、体分子上的两个抗原结合部位是相同的，位于两臂末端称抗原结合片段。Y的柄部称结晶片段，糖结合在FC 上。2、 抗原、抗体的作用 （一）抗原的功能和作用1、 细胞表面的免疫球蛋白被称为细胞表面抗原，它的主要作用是标志细胞自身且能刺激免疫细胞产生抗体。人体细胞表面抗原种类繁多，除同卵双生子外，不存在表面抗原完全相同的情况。最为人所熟知的表面抗原是标志ABO血型的A抗原、B抗原和H抗原，正是这些抗原的存在，使得人的血清中含有对应的抗体。当与不同血型的红细胞接触时，就会发生特异反应，即血液凝固。 2、存在于白细胞和其他一些组织细胞中的组织相容性抗原，称为人类白细胞抗原（HLA）。这是一种跨膜蛋白，具有很

5、强的细胞特异性，正是它的存在使得器官移植困难重重，它所产生的排异性甚至能摧毁整个器官。 3、进入身体的病毒或细菌，当它刺激T淋巴细胞产生抗体（或者说细胞因子）时，就被称为抗原。它的主要作用就是使身体的免疫细胞产生抗体。 4、作用：( 1 )用于检测：药物代谢、药物动力学。 （2）用于充当抗原：充当疫苗更安全、取代昂贵难制备的抗原。（二）抗体的功能和作用1、特异性结合抗原：抗体本身不能直接溶解或杀伤带有特异抗原的靶细胞，通常需要补体或吞噬细胞等共同发挥效应以清除病原微生物或导致病理损伤。然而，抗体可通过与病毒或毒素的特异性结合，直接发挥中和病毒的作用。2、激活补体：IgM、IgG1、IgG2和I

6、gG3可通过经典途径激活补体，凝聚的IgA、IgG4和IgE可通过替代途径激活补体。3、结合细胞：不同类别的免疫球蛋白，可结合不同种的细胞，参与免疫应答。4、可通过胎盘及粘膜：免疫球蛋白G（IgG）能通过胎盘进入胎儿血流中，使胎儿形成自然被动免疫。免疫球蛋白A（IgA）可通过消化道及呼吸道粘膜，是粘膜局部抗感染免疫的主要因素。5、具有抗原性：抗体分子是一种蛋白质，也具有刺激机体产生免疫应答的性能。不同的免疫球蛋白分子，各具有不同的抗原性。6、抗体对理化因子的抵抗力与一般球蛋白相同：不耐热，6070即被破坏。各种酶及能使蛋白质凝固变性的物质，均能破坏抗体的作用。抗体可被中性盐类沉淀。在生产上常可

7、用硫酸铵或硫酸钠从免疫血清中沉淀出含有抗体的球蛋白，再经透析法将其纯化。7、通过与细胞Fc受体结合发挥多种生物效应（1）调理作用IgG、IgM的Fc段与吞噬细胞表面的FcR、FcR结合，增强其吞噬能力，通常将抗体促进吞噬细胞吞噬功能的作用称为抗体的调理作用 （opsonization）。（2） 发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用 三、特异性抗原抗体的研究进展 1.抗血清的制备1.1 免疫动物 （1）抗原：免疫动物是制备抗血清的第步。免疫所用的抗原可用病毒、细菌或者其他蛋白质抗原，如果使用半抗原如小分子激素等，必须与大分子载体连接。抗原的用量视抗原种类及动物而异，次注射小鼠可以少至几个微克，免、

8、羊甚至更大的动物每次注射的量就相应增加，从几百g/次至几mg/次。（2）免疫动物：常用于制备抗血清的动物打豚鼠、家免、小鼠、大鼠等，如果大量生产可用动物羊、马等，动物接受免疫的乳液量小鼠为1020 mL，家兔为24mL。1.2抗血清的纯化与保存（1）采血：加强免疫的动物23次后，可通过耳静脉或眼球（小鼠）采血，进行抗血清效价测定。当效价达到理想的高度后，可以采血。采血方式可以从心脏直接取血，也可通过动脉放血。待血液凝固后用针筒或吸管吸取血清。（2）抗血清的纯化与保存：除抗体外血清中含有多种其他蛋白成分。为了避免这些蛋白质干扰抗体（免疫球蛋白）标记反应和抗原抗体反应，抗血清可经过纯化以获得单一的

9、机体（常为IgG）组分。常用的纯化IgG的方法为饱和硫酸胺盐析和层析法。蛋白质在不同的盐浓度的溶液中，其溶解度不一样，盐离子干扰蛋白质和水分子间氢键形成，因为水盐结合比水蛋白质结合更稳定，蛋白质即可从溶液中沉淀出来。蛋白质分子越大，沉淀时所需盐离子浓度越低。免疫球蛋白（Mr 1.5105）比血清中主要蛋白质白蛋白（M r 6.7104）的分子大得多，抗体在30%50%饱和度的硫酸盐中析出，而白蛋白需在70%80%饱和度才析出，因此常用33%饱和度的硫酸胺纯化血清中的IgG。盐析时为了减少抗体变性，需在4进行，同时用pH8.0缓冲液稀释抗血清，以减少蛋白浓度过高而发生共沉淀。铵盐的溶解度不随温度

10、变化而明显改变，0和25仅差3%，而钠盐则相差5倍，因此常在低温沉淀时用铵盐，室温沉淀用钠盐。铵盐对抗体的标记反应（如FITC和biotin标记时）有一定的干扰作用。盐析法只能部分纯化抗体，更高纯度的抗体制剂可用层析法制备。IgM五聚体相对分子质量达9.710，比血清中任何其他蛋白都大，用分子筛层析很容易将其纯化。IgG在PH 80时带负电荷，能与DEAE纤维素上的阳离子结合，因此可用离子交换层析来纯化IgG。IgG纯化最常用的方法为亲和层析。IgG与葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋白具合高度的亲和性，可用这两种蛋白质交联亲和层析柱将IgG纯化。大部分IgG与蛋白A结合PH为89，洗脱PH为24；而

11、与蛋白G的结合PH为57，洗脱PH为910。C蛋白更适合于IgG的纯化，不但反应条件为温和的弱酸性或弱碱性，并且与IgG的结合力高于A蛋白。G蛋自能与大部分动物种类的IgG结合，而A蛋白对小鼠IgG1、大鼠IgG2b、人IgG3、马和绵羊IgG结合力弱或不能结合G蛋白和A蛋白均不能与鸡IgG结合。1.3抗血清的特性鉴定根据不同目的制备的抗血清，对其中所含抗体的浓度，特异性及免疫球蛋白种类的要求也不一样。为了获得质量和数量上合符要求的抗血清，在收集动物血清前必须对免疫效果进行检测，对收获后的抗血清也必须对些参数进行分析，如效价、亲和力及交叉反应等。根据不同的抗原性质选用合适的检测方法。最常用的为

12、免疫沉淀，ELISA，放射免疫等。亲和力（affinity）表示抗血清与相应抗原的结合强度，是描述抗体持异性的重要指标，2.单克隆抗体的制备2.1 制备原理单克隆抗体（MAb）与抗血清（又称多克隆抗体，PAb）最主要的区别是MAb为单一种B细胞克隆所产生的一种均一的免疫球蛋白分子。所以MAb是B细胞克隆的标志，是一种独特型的抗体，它的特异性是针对一个抗原决定簇的。制备单克隆抗体不能用化学分离的方法从多克隆抗体中去分离纯化得到它，而是用分离产生抗体的B细胞克隆的方法得到它。为了使B细胞克隆能在体外人工培养下长期存活并产生完全均一的MAb，GKÖhler合Milstein于1975年创立

13、了杂交瘤方法。所以制备单克隆抗体的技术又称杂交瘤技术（hybredoma technique）。杂交瘤技术的基本原理是用分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能在体外长期培养并可低温保存的肿瘤细胞进行杂交。筛选得到的杂交瘤细胞应该是既能分泌抗体又有瘤细胞的特性，可长期传代培养，又可在液氮中保存的细胞。把这些细胞单克隆化，用单克隆化的杂交瘤细胞进行单克隆抗体的生产。22B细胞与瘤细胞的来源及杂交瘤选择原理最常用的单克隆抗体是小鼠的单抗，此外也有大鼠的和人源的单抗。人源单抗制备比较复杂。小鼠单抗的制备通常是使用Balb/c小鼠的B细胞和它的骨髓瘤细胞。大鼠的单抗制备通常用Lou/c大鼠及其骨髓瘤和Y3/

14、AO大鼠及其骨髓瘤细胞。B细胞是从免疫动物的脾脏中分离出来的。动物免疫方法与抗血清制备相同，只是在制备脾脏前3d必须进行一次静脉加强注射以保证得到的B细胞有旺盛的分泌抗体的活性。骨髓瘤细胞有许多细胞株是经过诱变和筛选得到的缺陷型。筛选的标准是瘤细胞本身不产生抗体或者产生抗体的某种链，但不能分泌；是次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷型。因为这种缺陷型的瘤细胞正常的核酸合成途径被氨基喋吟（aminopterin）阻断后，由于缺失这些酶，即使补充它的底物次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T），核酸合成的旁路也不能起到救援的作用，结果导致瘤细胞死亡（图72）。而杂交瘤细胞因带

15、有B细胞的全套基因，在HAT存在的条件下借助于HGPRT和TK的作用通过替代的核酸合成途径能正常合成DNA和RNA。所以杂交瘤能正常地生长繁殖而被选择出来。未被融合的游离的B细胞只能存活3d而后自行死亡。这就是用HAT培养基进行选择的原理。2.3细胞杂交与选择培养（1）融合：细胞杂交之前，要分别准备好脾脏的B细胞悬液和小鼠骨髓瘤细胞（如SP2/0Agl4细胞株）。免疫后的小鼠脾脏在无菌条件下破碎，将B细胞悬浮在没有血清的培养液中（通常使用RPMIl640商品配制），并洗涤3次去掉小鼠的血清。SP2/0细胞是用加有10%胎牛或小牛血清培养的，每天更换新鲜培养液使成为对数分裂期生长旺盛的细胞。细胞

16、用RPMIl640洗涤23次，把两种细胞合并在同试管中，用50%的聚乙二醇（相对分子质量为10001500）作为融合剂，在37条件下融合l2min。然后用1640培养液缓慢稀释，然后除去PEG，将细胞分散至HAT选择培养板中。电融合方法也可用于单克隆抗体制备，虽融合率较高，但一次融合的细胞数少，且需专门设备，故限制了其广泛使用。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例在5：110：1均可获得满意结果，每次融合细胞数量在1010较为合适。融合后的细胞在40或96孔板上的HAT培养液(RPMIl640含10%20%胎牛或小牛血清和HAT）中37，5%CO2条件下培养。融合后的细胞悬液中只有脾细胞和骨髓瘤细胞

17、形成的杂交瘤细胞能在HAT培养基中生长，其他形式的融合细胞均不能生长未融合的细胞也不能在HAT培养液中生存。在融合后的细胞培养过程中，饲养细胞（feeder cell）有助于杂交瘤细胞的生长。饲养细胞可用同种动物的腹腔细胞或胸腹细胞。（2）阳性杂交瘤细胞的筛选与单克降化：杂交细胞经约1014d培养后，形成可用的细胞集落（克隆）。经过几次更换培养液（HT培养液）后进行抗体活性检测。常用的筛选枪测方法是ELISA和凝集试验，前者常用于可溶性抗原，后者适用于细胞、细菌等表面抗原。此外，DotELISA、免疫印迹及免疫荧光试验均可用于杂交瘤细胞的筛选。2.4单克隆抗体的扩大生产产生特异性抗体的单克隆杂

18、交瘤细胞株应立即扩大培养，以获得足够的细胞用于保存和生产可供应用的抗体。生产大量单克隆抗体的方法目前常用的有3种：小鼠腹水制备，大瓶培养和中空纤维反应器，前者多用于实验室制备，后二者适应于工厂化生产。腹水制备：杂交骨髓瘤细胞在腹腔中定植，并产生大量腹水。选用与单克隆抗体制备所用相同的动物品系或者含有相同基因的Fl代杂交品系。杂交F1代品系更适合于腹水制备，如果用异源动物制备腹水时可选用无MHC限制性的裸鼠。用小鼠制备腹水时，先用矿物油或Pristane致敏，以抑制其免疫功能，利于腹水的形成。腹腔注射1010个杂交瘤细胞，经过710 d后形成腹水。每只小鼠可获得35mL腹水，每mL含IgG抗体可

19、达510mg。腹水中含有较多的杂蛋白和非特异性IgG，并且含有许多蛋白酶，易使抗体失活，因此腹水收集后应尽快纯化，以防止降解。5人单克隆抗体的制备小鼠的单克隆抗体蛋白应用于人体后，作为抗原能引起人的免疫应答，大大降低其生物活性，并可能导致变态反应。因此人源单克隆抗体在临床治疗上有广泛应用前景，引起人们的普遍兴趣。但是人单克隆抗体制备存在许多技术上和伦理上的障碍，如人杂交瘤细胞系不稳定，有些抗原不能对人进行人工免疫，人B细胞只能从外周血中分离而无法从脾脏取得等。尽管如此，一些人源单克隆抗体已经获得，技术上也在逐步完善起来。人的瘤细胞株U266常用来与人外周血B细胞融合以获得人源单克隆抗体。另一些

20、淋巴母细胞抹（LCL）则来源于EB病毒转化的淋巴细胞，如GMl500，W1L2和ARH77等也用于杂交瘤细胞的制备。这些细胞系表现ED病毒核抗原（EBNA）阳性，且形成的杂交瘤细胞抗体的分泌水平不高。获得人单克隆抗体的另一方法是用EBV直接转化某些抗体分泌细胞，使之成为“不死”的细胞在体外培养。EBV感染人B细胞后，病毒基因插入人B细胞基因组中，有1%的细胞转化为“不死”的细胞。B细胞转化可通过“病毒驱动”和“细胞驱动”两种方法获得。前者是将B细胞与分泌EBV的B958细胞系一同培养，后者则是与EBNA阳性的LCL细胞一同培养。“细胞驱动”转化的B细胞比较稳定，抗体分泌能力也较强。3、基因工程

21、抗体的制备3.1抗体的化学修饰抗体Fc段用双功能连接剂与荧光素，同位素，酶，发光化合物，稀土元素以及药物，毒素等连接后，并不影响其Fab功能区与特异性抗原结合。根据交联物的性质不同，标记的抗体可用作诊断试剂，也可作为药物的定向载体，引导药物或毒素到达抗原存在部位使药物或使毒素发挥更有效的作用，即俗称“生物导弹”。从而减少药物、毒素、同位素、酶在肿瘤治疗过程中引起严重的副作用，大大提高治疗肿瘤的效果。3.2抗体基因文库抗体基因文库（antibody recombination library）是将不同的重链和轻链基因随机组合，克隆到合适的表达载体中，在原核细胞表达不同的抗体，形成一个抗体库，从这

22、个抗体库中，用抗原可以筛选到相应的抗体基因。抗体基因来源于杂交瘤细胞或动物B细胞（免疫或未免疫）的DNA和mRNA。用质粒作为抗体文库的载体，虽然也可能表达有活性的抗体分子或片段，但由线状噬菌体表达更为方便有效。M13、fd、F1等噬菌体的外壳蛋白由5种蛋白组成：p、p、p、p和p。每种含量不一，其中p含量最多，每个噬菌体有2700个p亚基，其余4种蛋白仅5个拷贝。增加噬菌体外壳蛋白的长度并不影响噬菌体的装配，抗体以融合蛋白的形式表达于噬菌体表面。噬菌体表达质粒常用的有fdCAT1、fdtetDOG1、PHEN1、pComb3和pComb3H等。抗体融合蛋白构建多用p和p，p拷贝数高，低亲和力

23、的抗体蛋白容易筛选出来。在噬菌体表达抗体时，常常不表达完整的抗体分子，（因为CH2上不能进行糖基化）。根据不同的引物得到重链的VH或VHCH1区，轻链的VL或VLCL区。VL和VH两个片段用一短肽作连接片段，形成单链可变区（singlechain fragment variable，scFv）；VHCH1和VLCL两片段则形成Fab片段。另外，单独的VH和VL也能结合抗原，如果二者形成同源或异源二聚体（dAb），则稳定性和亲和性明显提高（图74）。此外在抗体片段DNA末端加上一些功能蛋白（如碱性磷酸酶和蛋白毒素）的基因，则表达的抗体就带有一定生物活性功能片段，可用于检测或治疗。用特异性抗原免疫

24、的动物B细胞构建抗体的噬菌体文库，抗体亲和性高，用与免疫抗原不同的抗原筛选得到的抗体亲和性普遍较低。可用模拟天然体细胞突变的方法来提高亲和力。33抗体基因的改造将鼠源抗体的V区基因与人源抗体C区基因重组，获得的嵌合抗体（chimericalantibody），可保留鼠抗体对抗原的高亲和性，又减弱鼠源抗体对人的免疫原性，提高治疗性抗体的效果。重组的嵌合抗体基因转化骨髓瘤细胞或中国地鼠卵细胞（CH0），可在其中表达。为了进一步地消除鼠抗体V区框架区（FW）的异源性，可实行CDR移植（CDR grafting），以获得与鼠FW类似的人FW结构的嵌合抗体。噬菌体表达的抗体仅含V区（scFv）或Fab片

25、段，缺乏Fc区，使抗体的稳定性下降，半衰期缩短，与Fc受体结合功能也消失。因此在抗体功能片段的末端连接A蛋白、酶、细胞因子、CD4和毒素等分子，既可增加抗体片段的稳定性，又可发挥某些生物学活性功能。3.4基因工程抗体在真核细胞中的表达噬菌体表达的抗体片段常常是在原核细胞中完成。原核系统表达抗体片段产量高，成本低，快速易于操作。但抗体片段在原核表达系统中不能进行CH2糖基化，从而影响抗体的活性。因此重组抗体基因片段可转移至适合的骨髓瘤细胞系或哺乳动物细胞系（如CHO），甚至于植物细胞中表达，可以得到与淋巴细胞表达相同的抗体分子。免疫球蛋白IgA的重链和轻链及分泌片基因可以分别转化不同的植株，将表

26、达这些蛋白的植株进行有性杂交，在杂交后代中可以装配成完整的IgA双分子。以植物作为生物反应器进行抗体的表达已有许多成功的研究报道，与动物细胞相比更为经济，具有广泛的应用前景。4、催化性抗体的制备4.1抗体催化的原理1986年，由PGschultz和RALerner分别领导的两个小组同时证明抗体具有催化活性。针对一个四面体带电荷的磷酸酯半抗原产生的抗体，能有选择性地催化相应的碳酸脂和羧酸脂的水解反应。他们将这种有催化活性的抗体称为催化性抗体（catalytic antibody)，又称抗体酶（abozyme）。催化抗体的作用取决于底物分子水解时的转换态（transition state）（图75

27、）。转换态的分子结构是分子活化后的一种结构状态，处于转换态的分子具有最高的活化能，分子表现极性。处于这种状态的分子也是最不稳定的，能与这种分子结合的酶或者抗体会使某些化学键发生断裂（如酯键，碳键，胺键等）起到酶解作用。可见抗体酶的作用与天然的蛋白质酶非常相似。抗体酶也表现出对底物的专一性，对立体结构的专一性。在饱和动力学与竞争性抑制方面都与常规酶相似。所以抗体酶的发现打破了只有常规酶才有的分子识别和加速催化反应的传统概念，为酶工程学开创了新的领域。4.2抗体催化的化学反应由抗体催化的化学反应特异性高于酶，但催化速率低于常规的酶，只有l010倍。但有一些未发现催化剂的反应，如DielsAlder

28、反应也能被抗体催化。常规酶一般不能催化胺键水解，抗体酶能使胺键水解的速度增加25万倍。迄今为止，已发现和证明的由抗体催化的化学反应不下40种。4.3催化性抗体的制备抗体酶是抗原决定簇处于转换态结构的抗体。因为转换态分子极不稳定无法制备抗体，所以催化性抗体的获得主要是通过设计稳定的转换态的类似物作为半抗原，与载体蛋白交联后，免疫动物，获得针对半抗原的抗体，从中筛选具有催化活性的抗体。筛选催化性单克隆抗体所用的ELISA与筛选一般抗体的方法不完全一样，应根据催化反应的特点而进行适当的修改。经典的方法是先筛选出与底物或半抗原结合的抗体，然后从中再筛选出有催化活力的抗体，这种方法费时费力。利用催化性抗

29、体对底物的催化活性，对底物进行适当修饰，使催化反应的产物可直接表现抗体的催化活性，这样可以简化检测步骤。从理论上看，B细胞具有全套免疫球蛋白的多样性的胚系基因，当然也包括有催化作用的自身抗体在内。然而1989年Paul W.首次报道了人体的一种能催化蛋白质水解的免疫球蛋白。它是种自身抗体，能水解血管活性肠肽（vasoactive intenstinal peptide，VIP）的Glnl6Met17键。用VIP作为抗原能得到有催化作用的单克隆抗体，也能催化Glnl6Met17键。大约有17%的人有这种自身抗体酶，但患有气喘的病人中该抗体与VIP的亲和力比健康人高50倍。由于VIP是一种气管松弛剂，因此有人认为这种VIP自身抗体的长期作用可能与气喘的过敏应答