生物芯片诊断系统应用指南(系统篇)

1、生物芯片诊断系统应用指南(系统篇)深圳欣康基因数码科技有限公司 生物芯片技术的应用是医学发展的必然趋势从生物信息角度看传统医学是在下游信息即机体表型（症状、病理、生理）上获得诊断信息的，而未来医学是从DNA、RNA、蛋白质这些上游信息中获得诊断结果的，更具有确定性和预见性。未来的医学是以生物信息为核心的分子医学，DNA、RNA、蛋白质称为生物信息大分子，其质和量的异常变化与疾病直接相关，是一切疾病的根本原因。然而生物信息所包含的信息量十分巨大，根本无法用传统的方法处理，为此, 生物芯片，一项将计算机芯片制作技术与生命科学研究相结合的新兴技术应运而生了！生物芯片是指采用光导原位合成或微量点样等方

2、法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、生物膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。生物芯片技术是九十年代初应人类基因组计划而在美国率先发展起来的一项高新技术。经过十年的发展，该技术已显示出极其广阔的应用前景。作为新一代生物技术，将从根本上改变目前生物学和生物技术的观念和效率，它将是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命，它将改变生命科学的研究方式

3、，革新医学诊断和治疗。可以相信，生物芯片技术应用于临床诊断是诊断技术的一次革命性进步、是未来医学发展的必然趋势。欣康生物芯片诊断系统是深圳欣康公司依托第四军医大学开发，国内首批具有国家批准资质和自主知识产权的医学临床生物芯片检测技术，其整合了生物技术、芯片技术、光机电技术、软件和网络技术等诸多高新技术，相当于一个“流动的临床检测中心”，可以覆盖大多数临床常见病、多发病、极大地提高医院的诊断水平，为患者提供集成化、网络化临床分子诊断整体解决方案。应用生物芯片诊断系统结构和功能欣康生物芯片诊断系统由生物芯片、生物芯片阅读仪（XK-2100型）和生物芯片在线等三部分组成。欣康生物芯片目前主要为蛋白芯

4、片，采用基因工程表达、天然提纯和人工合成待测微生物（或目标蛋白）的特异性抗原（抗体），将抗原或抗体以微矩阵形式固定于硝酸纤维素膜（NC膜）上，待检标本中的特异性抗体（抗原）与之发生特异性免疫结合反应，并在NC膜上形成抗原-抗体免疫复合物，再用金标记或酶标记的二抗与该复合物特异性结合，直接显色或者催化相关底物显色，最终产生生物芯片阅读仪可捕捉和分析的信号。XK-2100型生物芯片阅读仪集光学、机电、生物医学、计算机、影像学等多学科技术于一体，配备MARA生物芯片分析软件，将生物芯片产生的信号通过图像采集、光电模数转换和量化后形成数字化的图像文件，从而实现对生物信号定性和定量的分析。阅读仪一次能读

5、取6张芯片数据，自动一键式取样分析和出具检测报告，大大缩短检测时间；同时该软件还具有芯片图像储存、分析、报告、统计和日常管理等多种功能，灵活的管理系统可帮助您建立一个丰富的芯片检测结果和病历资料数据库。生物芯片在线作为生物芯片技术在线服务网络，随着生物芯片的推广应用，将成为一个具备芯片技术推广与产品销售、健康咨询与教育、远程诊断与分析等多功能的大型医学数据库和健康服务网络。 生物芯片诊断芯片的应用整体系统应用流程图解见下图1，幽门螺杆菌(Hp)微矩阵抗体检测试剂盒操作说明书（举例，部分）见图2，阅读仪和软件操作（主要界面）见图3样品准备和处理（膜片、血清）加血清反应洗涤加标记抗体或二抗洗涤显色

6、（金标或酶标）送入生物阅读仪输入患者资料软件计算分析检测报告输出（主要过程自动完成）图1：生物芯片诊断系统操作流程图解幽门螺杆菌(Hp)微矩阵抗体检测试剂盒说明书。【使用目的】幽门螺杆菌Hp是引起慢性活动性胃炎的主要病原菌，是消化性溃疡病的主要致病因子，也是胃癌发生的一个重要协同因子。Hp微矩阵抗体检测试剂盒可同时一次检测Hp的多种血清学标志（抗CagA、抗VacA、抗Ure、抗RdxA、抗Hsp60等抗体）。用于Hp感染的流行病学调查和临床的辅助诊断。【试验原理】幽门螺杆菌微矩阵采用基因工程技术表达Hp特异性抗原(CagA、VacA、Ure、RdxA、Hsp60)，将具有抗原性的蛋白以方阵形

7、式固定于硝酸纤维素膜(NC膜)上，待检标本中的特异性抗体与之发生特异性免疫结合反应，并在NC膜上形成抗原抗体免疫复合物，再用胶体金标记的葡萄球菌A蛋白(作为二抗)与该免疫复合物特异性结合，最终出现肉眼可见的红色斑点。【主要组成成份】Hp微矩阵 10片 洗涤液(8ml瓶) 1瓶标记物(2.5ml) 1瓶 使用说明书 1份【适用仪器】 XK-2100生物芯片阅读仪（注册号：粤药管械（试）字2003第号）【样本要求】采集静脉血1ml盛于干燥管中，离心分离血清。血清可以立刻进行检测试验；如不立刻作试验，可将分离的血清放置4保存(可放置3天)，或放置-20长期保存。【试验方法】在微矩阵窗口内加洗涤液(约

8、150l)，均匀湿润所有膜面；取待检血清100ul，用移样器均匀加入微矩阵检测窗口内所有膜面，待血清渗入后，再加洗涤液(300l)，洗去残留的血清。将标记物(200l)，均匀加入窗口内所有膜面，待渗入后，再加洗涤液，洗去窗口膜面上残留的标记物。显色后的微矩阵应在30分钟内用阅读仪进行结果判定。图2：幽门螺杆菌(Hp)微矩阵抗体检测试剂盒操作说明书（部分）资料输入界面检测界面报告界面图3：阅读仪和软件运行（主要界面）生物芯片操作要点：1、 根据临床检测需要选择不同的生物芯片种类，芯片的分类和具体应用请见生物芯片应用指南。2、 目前芯片检测的样本为血清，但随着芯片研发的深入和品种的需求，样本的种类

9、也将会不断拓展。为保证反应的特异性和免受过多干扰，建议使用新鲜血清，并在使用前离心，离心转速5000rpm；如使用较长时间存放的血清，离心转速应大于8000rpm。3、 为保证芯片上反应的顺畅进行和减少非特异性反应，在芯片操作过程中需要反复洗涤芯片数次。4、 目前大部分芯片会在10分钟内反应完成并显色，部分芯片需要时间在20分钟左右。5、 欣康公司产品工程师将负责生物芯片阅读仪及分析软件的安装、调试和培训工作，确保系统正常和正确使用。具体见生物芯片阅读仪和软件操作使用说明书（随机安装于电脑中）。6、 软件操作时需要输入患者资料和检测参数，患者资料包括姓名、年龄等；检测参数将随生物芯片使用说明书

10、附上，主要包括cutoff值（用于界定阴阳性）、kb系统值（用于定量分析标准曲线设定）、critical值（用于定量分析中分段函数界定等），每批芯片的参数可能均有变化，使用前请注意。检测参数的具体含义和使用见下文。7、 输入完成后，按检测键，所有操作将可以自动完成，包括自动取样摄像、自动计算分析、自动保存和自动打印检测报告。如不需自动或者对某部分不需自动操作，软件提供了个性化设置界面，自行选择。8、 软件设有统计和数据库功能，医生可以使用统计功能根据所选择的项目进行统计计算，数据库中存储了所有检测过的资料，方便进行对检测结果进行定性定量化数据查询和调用关于检测参数的制定、使用和检测的定性、定量

11、分析1、 cutoff值（本节简称cf）cf主要用于定性和半定量分析，在抗体检测中经常使用，通过比较检测结果的数据和cf判断检测的阴阳性，大于cf为阳性，小于为阴性，在cf上下5范围为临界区域。见下图示意cutoff临界区域图4：弓形虫抗体检测及cutoff（示意）Cf按照国家标准，通过大量阴性血清检测并对数据进行统计处理获得。Cf本质和检测结果的敏感性和特异性相关，并具备一定的调节范围。如需检测获得更高的敏感性，则可以考虑适当调低cf；如需严格控制检测的特异性，则可以考虑适当调高cf。具体应用中一般不建议调节cf，如科研考虑或者特殊要求，请与公司客服部门和技术部门联系。检测项目的检测数据和c

12、f的配合使用可以应用于抗体的半定量分析，设定一个Y值，YX（检测数据）cf）/cf，反应抗体水平的相对高低，在检测报表中的图表上显示，可以辅助医生进行纵向比较患者一个阶段的抗体水平变化和横向比较同类患者的抗体水平，更好的判断病情病程和治疗预后方案。2、 kb系统值（本节简称kb）kb主要用于定量分析中标准曲线制定，在蛋白定量检测中经常使用。定量分析蛋白水平，传统上一般需要每次自行绘制标准曲线。使用本公司的蛋白芯片进行定量分析，标准曲线不需要每次自行绘制，而由本公司直接提供相关参数并存于电脑中，在检测过程中自动分析并转化为蛋白的绝对浓度指标显示于检测报告单中图5：蛋白芯片定量检测示意为配套定量分

13、析，本公司将使用国家或者国际标准品连续多次进行测试并计算，绘制标准曲线并取得kb，标准曲线一般均以直线模式提供，见示意图。当然，标准曲线因检测蛋白和方案不同可能有多种图形，本公司将尽可能转化为直线模型，转化的程序也将内含于软件中而不需要检测人员特别输入。如有个别或特殊的无法以直线模型提供标准曲线，公司提供的检测参数将特别说明。3、 critical值critical主要用于标准曲线中分段函数或者分点计算的界定。使用蛋白芯片定量分析蛋白水平，将有可能比传统方案更大的扩大检测的范围（几倍、10倍、100倍），这种扩大的实现，可能是通过分段函数和分点计算的模式，critical提供了界限值，程序将自

14、动根据该值判断计算。Critical的制定类似于kb的制定。4、 其他在检测过程中，软件将显示蛋白的3维分析图形（见图1的软件显示），有利于医生更全面的把握生物芯片反应和检测结果。根据检测项目的个性化原因还存在一些其他参数，如唐氏检测过程中的默认中位值参数等，均已经内含于相关专用软件之中，不需特别输入。其他的检测参数相信也会随着蛋白研究的深入和生物芯片种类的增多逐步出现，一般而言会采取内含形式出现，从而帮助更为准确的分析和判断。关于检测报告单的解读1区2区3区1区2区3区图6：生物芯片诊断报告单（举例）生物芯片诊断系统由软件安排出具和打印检验报告单，格式根据检测对象会略有变化，图4是报告单的典

15、型格式的示意（性传播疾病抗体检测结果报告单和唐氏综合征检测结果报告单）。1区为信息区。如图所示包括患者姓名、性别、年龄，检测医生和送检医生的姓名等信息，这些信息是由软件中原输入的资料所决定，不需重新输入。2区为检验结果区，显示所操作的生物芯片中各项目的检验结果。目前抗体的检测结果采取定性方式显示，包括“”（阳性）、“”（阴性）、“”（临界）3种结果，各项指标均以该方式显示，如上图显示梅毒抗体的检测结果为阴性；定量分析中目标蛋白的检测结果，一般采取定量方式显示，直接给出检测的绝对数值，单位根据情况有多种形式，如ng/ml、IU/ml、MOM等，如上图显示AFP的检测结果为20.21IU/ml。3

16、区为定性定量分析图表，以图表形式更深入诠释和分析检验结果。在抗体检测的图表中，以半定量结果分析为依据（具体模式见本文中cutoff一节），项目检验数据小于cutoff代表阴性，不显示计算数据；大于cutoff为阳性，以半定量计算数据在曲线旁边显示，如上图中CT半定量数据为0.5，UU半定量数据2.6。同时医生也可以根据患者连续检测中半定量数据的变化结合其他情况对病情综合判断。根据公司内部技术标准设定3处参考，临界区代表检测数据在cutoff上下5范围内的样本，为临界血清（样本），其检测结果可能会因检测的重复性影响在cutoff值附近波动，甚至引致重复检测该样本时，阴阳结果交替出现的现象，需谨慎

17、处理。弱阳线和强阳线参考为判断抗体强弱的依据，高于强阳线为抗体数量高，反应强烈；低于弱阳线为抗体数量少，反应微弱，甚至反应可能为较强的非特异性反应，处理结果应带有一定的谨慎性。这3处参考是公司根据大量的临床检测统计设定，作为医生检验时的临床判断参考，但不能作为绝对标准。在目标蛋白的定量检测中，直接在图标曲线旁显示该蛋白的绝对定量数据或者标识测试结果的计算结果，如上图所示，HCG的MOM为1.98，唐氏综合风险为1/1447；同时，也会在图表上配置相关的标准参数，如唐氏风险的判断阈值1/275即标识于图表中。生物芯片有关性能指标的说明准确性芯片检测的准确性指标是指标检测的敏感性和特异性指标的总称

18、。准确性的计算是随机选择血清标本通过与国家国际标准品的对照，或者通过已经审批通过的检测试剂盒的对照，在此基础上的测算。限于篇幅，仅举例说明方法和过程。分别使用德国RECI的优生优育系列ELISA试剂盒、美国ZEUS的优生优育系列ELISA试剂盒对收集的血清标本进行IgG抗体检测，选取其中两者结果相一致的血清200人份，再次使用TORCH生物芯片实施检测，最后以ZEUS试剂盒检测结果为标准计算生物芯片检测的准确性指标，结果数据见下表：微矩阵（CMV）ZEUS ELISA试剂盒小计阳性阴性阳性1620162阴性142438合计17624200巨细胞病毒准确性指标：敏感性= 92%；特异度=100%

19、；YI指数=敏感性+特异度-1=0.92。微矩阵（RV）ZEUS ELISA试剂盒小计阳性阴性阳性1647171阴性92029合计17327200风疹病毒准确性指标：敏感性= 94.8%；特异度=74.1%；YI指数=敏感性+特异度-1=0.689。微矩阵（TOX）ZEUS ELISA试剂盒小计阳性阴性阳性101阴性0199199合计1199200弓形虫准确性指标：敏感性= 100%；特异度=100%；YI指数=敏感性+特异度-1=1。微矩阵（HSV-）ZEUS ELISA试剂盒小计阳性阴性阳性591473阴性9118127合计68132200单泡病毒准确性指标：敏感性= 86.8%；特异度=

20、89.4%；YI指数=敏感性+特异度-1=0.762。表1：TORCH检测芯片准确性对照试验重复性（精密度）重复性是针对一份相同标本血清同时多次检测所得结果的差异而言，差异越小，重复性越好。定性检测中可以使用阴性结果和阳性结果的比率，也可以使用总比率表示；定量检测中一般使用差异系数CV表示，CVS/X（S：多次检测的标准差，X：检测平均值）。临床检测中重复性是和准确性同样重要的指标。蛋白芯片的检测重复性只与整体系统的性能相关，而与具体哪种芯片、哪种检测项目没有关系，是芯片平台技术的直接体现。影响芯片重复性的因素包括生物芯片点样、载体、标记、芯片组装、反应和芯片阅读仪图像采集和数据化性能。由于芯

21、片系统具备数据化的突出能力，一般使用CV表示芯片的重复性。如上所述，我们采取一种蛋白抗体的检测介绍芯片的重复性。选用幽门螺杆菌中的CagA抗体检测指标，生产3批该芯片，然后挑取10份已知阳性血清，每份血清均从这3批芯片中每批随机挑选6张芯片共18张芯片，同时检测完成后使用芯片阅读仪分析检测结果，并分别计算每份血清的批间CV（3批综合计算）和批内CV（每一批分别计算），结果见下图表。 批次血号批内CV(%)批间CV(%)检测平均值ABC13.24.64.35.4125.425.76.75.87.577.035.35.85.56.3106.547.43.88.48.762.654.55.14.45

22、.7111.365.88.06.98.855.177.68.84.29.845.386.35.76.27.372.195.46.74.26.889.9107.67.46.28.350.4表2：Hp检测芯片重复性试验图7：生物芯片检测的重复性（CagA,阳性血清）经多次反复使用上述模式（检测指标不同）测算，生物芯片平均CV15，重复性强于大多数传统检测方法。同时可以看出：CV和批间批内相关，批间CV大于批内CV；CV和芯片读值相关，读值越高，CV越低。定量重复性的特点显示，对于较明显的阳性和阴性血清，定性检测结果的重复性是100；但对于比较接近cutoff值的血清，在定性检测中是可能出现阴阳并存

23、的，也是需要引起检测人员特别注意和谨慎处理的。灵敏度主要用于项目的定量检测。灵敏度是指抗体或者抗原蛋白的最低检测量，一般使用质量浓度或者效价表示，如ng/ml，1：512等。灵敏度不仅和生物芯片平台技术相关，也和具体检测的抗体和蛋白指标相关。经多次定量方面的研究，目前生物芯片诊断系统可以达到1ng/ml的检测灵敏度，和ELISA方法相当。产品设计中会根据检测目标的情况和要求去调节设定灵敏度。如心梗联检中肌钙蛋白I的灵敏度为1ng/ml，肌红蛋白的灵敏度为100ng/ml。线性范围（检测范围）在项目的定量检测中可能出现该指标。因项目不同而不同。线性范围是指检测过程中对目标能够准确定量的范围，包括上限和下限。生物芯片由于实施多点组合和具备强大的数据分析计算能力，在某些