010 第2章免疫球蛋白.ppt

1、,冯永堂,第二章 Immunoglobulin -Antibody,Polyclonal antibody (pAb) Monoclonal antibody (McAb) Genetic engineering antibody,Immunoglobulin (Ig),Ig是指具有抗体(Ab)活性或化学结构与Ab相似的球蛋白。 Ig与Ab: Ab是Ig, Ig不一定都是Ab。,第一节 免疫球蛋白分子的结构,一. 免疫球蛋白的基本,Porter和Edelman-的研究证明了Ab的结构. “Y”型 -S-S-连接的四肽链结构(两长两短),Gerald Edelman,Rodney Porter

2、1917-1985,(一)重链(H)与轻链(L),长链为Heavy chain(H) 短链为Light chain(L),L分型型,(二) V区（veriable region）和C区(constant region),V区-H的1/4和L的1/2近N端 C区-H的3/4和L的1/2近C端,V区与互补决定区（complementaritydetermining region，CDR）,VH和VL中各有3个区域氨基酸组成和排列顺序高度可变称高变区（hyper veriable region ,HVR）或CDR. HVR1=(CDR1), HVR2= (CDR2), HVR3= (CDR3). C

3、DR之外的区域称骨架区 （framework region, FR）,（三） Ig的结构域或功能区,结构域指每条Ig肽链折叠形成的多个球型结构,每个约有110AA组成,一般具有相应的功能(功能区). IgG, IgA, IgD: L有2个, H有4个 L chain: VL, CL H chain:VH, CH1, CH2, CH3 IgM, IgE: L有2个, H有5个 L chain: VL, CL H chain:VH, CH1, CH2, CH3, CH4,VL, VH（CDR)-抗原特异性结合部位,独特型抗原决定簇部位 CH1-同种异型的遗传标记 CH2, CH3(IgM)-补体C

4、1q结合点，激活补体 IgG CH2-通过胎盘 IgG CH3-结合FcR发挥调理吞噬,介导ADCC。 IgE CH2和CH3-与肥大细胞和嗜碱性性粒细胞IgE的FcR 结合,介导超I型敏反应 (四)铰链区(hinge region) ： 适于V区同抗原的结合, 含大量脯氨酸，富有弹性和伸展性， 利于暴露补体结合位点, 铰链区 是Ig亚类划分的依据.,各功能区的作用:,二. Ig的立体结构与Ig超家族,Ig肽链有独特折叠(fold)结构, 属片层( -sheet)结构,其走向与分子长轴平行. 每个Ig折叠有两个片层,每个片层包括3-5个反平行的折叠股, 两个片层中心的两个半胱氨酸残基之间有一对

5、二硫键垂直连接,形成一”-桶状结构”.凡凡有Ig独特折叠结构的分子,统称为Ig超家族(immunoglobulin superfamily,IgSF),三. Ig的J链和分泌片,四. Ig的水解片段,第二节 抗体的异质性,抗体的的异质性(heterogeneity)即Ig分子的不均一性。 异质性可表现在Ig肽链的V区，也可表现在Ig肽链的C区。,一. 抗体V区和C区的异质性,（一）抗体V区异质性 不同的抗原表位可诱导产生同一类Ig, 但同一类Ig识别抗原的特异性不同,这种不同关键是Ig的V区中HVR（CDR） 的差异。 抗体V区的异质性是抗体多样性的主要原因。 自然界抗原多样性是导致抗体V区异

6、质性的主要原因。,（二）抗体C区的异质性,(1)不同抗原表位可刺激机体产生不同类型的抗体 (2)同一抗原表位刺激机体产生的抗体,其识别抗原的特异性相同,但其重链与轻链的C区可有差异。,根据抗体C区的不同可分： 1. 类(class): CH的不同 2. 亚类(subclass):铰链区的差异及H -S-S-差异） 如IgG分为IgG1,2,3,4 3. 型(type): CL的不同分：型型 4. 亚型(subtype): CL的AA排列差异: 14亚型,Ig类、亚类、型、亚型都是抗体C区免疫原性的差异所决定的，即Ig C区抗原表位所决定的。 应用抗不同H和L链C区的抗体可将Ig分为不同的血清型

7、。 （1）同种型（isotype) ： 同一物种所有个体同一类Ig 共同具有的抗原特异性标志。 （2）同种异型（Allotype) ： 同一物种不同个体间Ig C区具有的不同抗原特异性标志。,同种型,同种异型,二、 Ig的独特型（idiotype，Id）,是指不同B细胞克隆产生的抗体V区上所独有的抗原特异性标志，在TCR/BCR的V区上也有Id。决定Id的表位称为独特位（idiotope）。,Id表位可刺激异种、同种异体及自体产生抗Id抗体（anti-idiotype antibody ，AId ）。,每一种Ag表位可诱导产生一种特异性Ab，每一种特异性Ab都有各自的Id。Id分布于Ig的VH

8、和VL。 Id主要覆盖抗体的抗原结合部位，即CDR及接近这一部位的骨架区(FDR)部分,（一）Id和AId的分类,1、独特型的分类 按Id特异性：分个体（私有）Id和公有（交叉反应性）Id 1） indivivdal Id（IdI）： 某一特异Ab或TCR/BCR上V区所独有的Id。与DJ基因编码的CDR3关系密切。 2）crossreactive Id（CRI或IdX）： 是功能上有关联的Ig或TCR/BCR上V区所共有的Id。,2、抗独特型（ AId ）的分类,Bona分类法-根据AId与Id反应的特点及AId抗体（Ab2）的功能 分： Ab2、 Ab2、Ab2、 Ab2 （1）Ab2：识

9、别Ab1骨架区相关的独特型。 Ab2与Ab1结合不影响Ag与Ab1的结合（属半抗原非抑制性Ab2）。可具有促进或抑制Ab1克隆的增殖作用。,2）Ab2： 类似原始的抗原表位，可模拟抗原诱导的特异性抗体产生或细胞免疫应答(“内应像”作用），可抑制Ab1与相应抗原的结合反应。 Ab2与模拟的抗原之间在特定部位有较高的同源性。 Ab2可诱导出特异性与Ab1相同的Ab3。,（3） Ab2 可识别Ab1上与补位相关的独特位。可抑制Ab1与相应抗原的结合，属半抗原抑制性Ab2。也具有调节作用，促进或抑制带有相应Id细胞克隆的增殖。,（二）Id及AId网络,抗原,Jerne简化的免疫网络学说示意图,（三）I

10、d和AId网络与免疫调节,抗Id抗体在医学中的应用,1、抗独特型抗体与疫苗 制备Ab2作为抗原的模拟物，代替病原体抗原诱导特异性免疫应答，即所谓抗独特型疫苗(aId vacccine) aId vacccine的优点： （1）不带有传染性物质 （2）可大量制备抗Id的单抗 （3）某些抗Id可模拟碳水化合物性的保护性抗源决定族（而DNA重组技术无法实现） (4)能诱导比灭活病毒更为有效的T细胞应答 （5）能诱导抗原决定族特异性的抗独特型疫苗,2 、抗Id抗体与某些自身免疫病 发生有关的实验研究,重症肌无力（MG）患者体内除发现有抗AchR的自身抗体外，还可能含有针对Ach抗体的抗Id抗体（Ab2

11、）。 Ab2可作为Ach的模拟物封闭神经肌肉接头的AchR，从而导致神经肌肉接头功能障碍，发生MG。,3、抗Id抗体与肿瘤免疫治疗,Lery等应用杂交瘤技术制备了针对病人结节性淋巴瘤B细胞Ig的AId（4D6)，获得一定疗效.,死亡,B,第三节,Ig的生物合成与表达(自修),第四节 Ig的生物学特性,一、Ig的主要生物学功能 （一）V区的功能 1、识别结合抗原：发挥体液免疫效应 如: 抗毒素(Ab) +毒素-中和毒素的毒性 抗病毒抗体+病毒-阻止病毒感染 2、免疫调节： Id和AId网络 3、超抗体活性,指抗体可在抗原结合部位以外的部位（V区的骨架区）与多种配体结合，从而发挥多种功能。,（二）

12、 C区的功能,1、激活补体IgM/IgG1,2,3 抗体+细胞(菌)+补体-溶解细胞(菌) 2、结合细胞表面的FC受体-介导其它效应 （1）调理作用（opsonization）: （2）ADCC作用 (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity): 有FC受体的杀伤细胞(M、中性粒、NK)，借助识别FC段杀伤被IgG包被的靶细胞。 （3）FcR介导型超敏反应 （4）过胎盘及粘膜,二、各类Ig的特性与作用,IgG： 1.含量最高、 分布最广 2.再次应答的主要Ab 3.活化补体、 4.结合吞噬细胞上的FcR介导调理吞噬 5.抗感染、中和毒素的主要A

13、b 6.过胎盘 7.结合SPA 8.介导ADCC,IgM,1. 分子量最大 （巨球蛋白） 2. 五聚体形式存(血清） 3. 产生最早 4. 活化补体能力最强 5. 天然的血型抗体 6. 血管内抗感然Ab （早期防御感染） 7. 膜Ig-BCR成分,IgA,两种形式存在 单体- IgA （血清型） 二聚体- SIgA （分泌型）, 2SIgA可过粘膜、婴儿可经初乳获得 3 SIgA是粘膜、腺体分泌液中主要Ab-发挥粘膜局部免疫作用,IgD,1 . 铰链区最长、半寿期较短（3天） 2. mIgD是成熟B细胞的BCR,IgE,1血清含量最低 2亲细胞性强 3介导型超敏反应 4抗寄生虫感染,第五节 I

14、g基因超家族,凡有与Ig结构（独特折叠结构）相似，遗传基因同源的蛋白质分子,统称为Ig超家族(immunoglobulin superfamily, IgSF)。编码IgSF的基因称为Ig基因超家族。,IgSF种类繁多、分布广泛、功能各异。 如：Ig、MHC分子、 Ag受体、某些 CD分子、黏附分子、 IgFcR、CKR等,一代Ab (pAb) ：人工免疫技术制备 二代Ab(mAb) ：杂交瘤技术制备 三代Ab(基因工程Ab)：分子生物学技术制备,第六节 人工制备Ab技术,人工抗体（Ab）技术,(1),一. 多克隆抗体(Polyclonal antibody),1. 概念 给动物接种抗原所获得

15、的免疫血清或抗血清是多种抗体的混合物, 它是由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的, 称为多克隆抗体.,B1,B2,B3,B4,(含Ab1,2,3,4等),2. 多克隆抗体的应用 免疫学诊断 被动免疫治疗和紧急预防 3.存在问题 特异性差, 用于免疫学检测容易出现交叉反应 异质性问题,容易出现过敏,二. 单克隆抗体(Monoclonal antibody,McAb),1. 概念: 由识别一种Ag表位的B细胞克隆产生的同源性Ab，称mAb。可由杂交瘤技术生产。,1975年，Kohler和Milstein杂交瘤技术的建立,使抗体技术得到了广泛的应用和发展-细胞工程产生的鼠源单克隆抗体,Ge

16、oreges Kohler,Cesar Milste,基本原理,致敏的B淋巴细胞能分泌特异性抗体，但这些细胞不能在体外存活。 骨髓瘤细胞可在体外大量繁殖，但不能分泌特异性的抗体. 将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，则融合的杂交瘤细胞既具有肿瘤细胞易繁殖的特性，又具有B淋巴细胞能分泌特异性抗体的能力。 克隆化的杂交瘤细胞能够分泌针对单一抗原决定簇的单克隆抗体。,2. B细胞杂交瘤的类型,骨髓瘤细胞 B细胞 小鼠-小鼠 大鼠-大鼠 小鼠-人 人-人,3. 杂交瘤技术流程,(2) 细胞融合,融合后细胞的类型: 未融合的脾细胞 杂交瘤细胞 未融合的瘤细胞,4. 单克隆抗体的特性,结构均一、型别相 纯度高、

17、特异性强 效价高、可体外连续生产、 诊断上-避免交叉反应 治疗上-制备生物导弹,5 .单克隆抗体在医学上的应用,用作诊断试剂 1)检测细胞表面分子，区分不同分化 阶段的细胞， 如鉴别淋巴细胞亚群。 2)鉴定病原体，准确诊断传染病。 3) 用于各种肿瘤的诊断和分型 4)各种细胞因子的含量测定 5) 用于测定体内激素含量，判 断内 分泌的功能状态,用作研究工具 纯化抗原 分析和探查抗原结构 分析抗原决定簇分子的功能 用于疾病的治疗 抗T细胞单抗，用于移植排斥反应的防治 抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治疗 抗肿瘤单抗用于肿瘤的生物导向治疗,异种抗体反应 鼠源性单抗用于人体，抗-单抗的产生. 导致

18、异源性蛋白超敏反应.,单抗体用于免疫治疗存在的问题,三. 基因工程抗体(Genetic engineering antibody),概念： 根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后构建成抗体基因载体,导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。,基因工程抗体类型,主要包括 嵌合抗体（chimeric antibody） 改型抗体（reshaped antibdy） 小分子抗体(minomoleculay Ab)包括: Fab片段Ab Fv抗体及 单链抗体（Single chain Fv antibody,scFv） 双链抗体（Diabody） 双价抗体或双

19、特异性抗体（bispecific antibody） 重组Ab-免疫毒素 等,(一)改造鼠源性抗体,1、嵌合抗体 (chimeric antibody) 从杂交瘤细胞分离出功能性Ig可变区(V)基因，与人Ig恒定区(C)基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。,嵌合抗体,1984（Mo rrison）,嵌合抗体特点：,1）保留鼠单抗特异性 2）降低对人体免疫原性 3）体内半衰期延期 4）有更强活性 5）可更换Ig类、型、亚型 6）体外传代稳定 7）产量高、商业价值高,2、 改型抗体（reshaped Ab）或人源化抗体 (humanized Ab),用CDR移植技术，将人

20、-鼠V区IgCDR置换，保留人FR,产生的抗体，亦称为CDR移植抗体。即改型抗体或人源化抗体。 改型抗体对人体免疫原性比嵌合抗体显著减弱。,特点： 1）最大限度克服鼠源单抗在 人体的免疫原 2）应用价值高如：治疗白血病 缺点：技术难度大,3、 小分子抗体,能与抗原结合的抗体小分子片段称为小分子抗体。 包括Fab、Fv及单链抗体（Sc Fv）、双特异性抗体、单区抗体（H链V区单链）等。 优点: 分子量小，免疫原性弱, 渗透力强。,(1)Fab片段抗体：,Fab片段由H链VH-CH1段和完整L链通过二硫键形成的异二聚体，仅含一个抗原结合位点。(用木瓜水解酶消化抗体IgG可获得2个Fab片段)。,F

21、ab 抗体分子的制备,仅有VH-CH1段组成，为单体Ab分子1/6。,(3)Fv片段,用适当的接头蛋白基因将L链和H链的V区基因连接起来，转染表达使之形成单一的多肽链，称为单链抗体（single chain Fv, ScFv）。完整Ab分子1/6。,（4） 单链抗体(single chain antibody),优点: 分子量小，免疫原性弱, 渗透力强。 缺点: 是无抗体C区，不能介导抗体的其它生物学效应。,用途: 可用于肿瘤的药物导向治疗 中和毒素治疗 肿瘤的影像分布诊断 制备诊断用蛋白生物芯片,5、最小识别单位(minimal recognition units,MRU) 仅有单个CDR构

22、成，分子量约为完整Ab分子的1%。,6、双价小分子抗体 将连接ScFv的接头蛋白缩短,7、双特异性抗体 (bispecific antibody, BsAb),BsAb也称双功能抗体或杂交抗体，为非天然抗体。其两个抗原结合部位具有不同的特异性，因此，化学结构上虽是双价的，结合抗原的功能却是单价的。,BsAb用途： 由于其双特异性，它可以同时与两种抗原发生发应并使之交联，因而可介导标记物与靶抗原结合，或使某种效应因子定位于靶细胞，在介导肿瘤的细胞杀伤中尤为有用。,BsAb制备方法,1)化学交联BsAb BsAb制备始于化学交联。分别分离纯化两种亲本单抗,采用还原剂使其解链,获得单价抗体。之后采用异双功能交联剂,把两种具有不同抗原特异性的单价抗体或其片段交联起来。 2)细胞工程BsAb 通过细胞融合的方法制备BsAb。可将分泌单抗的杂交瘤与经免疫的脾细胞融合，或使两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤彼此融合。 3)基因工程BsAb 多采用抗体分子片段，如Fab、Fv或ScFv，经基因操作修饰后，或体外组装为BsAb，或直接表达分泌型的BsAb。,BsAb作用原理,Bs