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1、3、高效液相色谱法 一、 概述 液相色谱法不受试样挥发性和热稳定性的限制，适合分离生物大分子、离子型化合物、不稳定的天然产物和各种高分子化合物。 包括四种基本类型： 分配色谱 吸附色谱（液固色谱） 离子交换色谱 尺寸排阻色谱（凝胶色谱）,二、 高效液相色谱仪 一般分为四部分：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。 高压输液系统由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器，核心是输液泵，要求压力足够、平稳、流量恒定、范围可调 进样系统：直接注射、停流、六通阀 色谱柱：一般采用优质不锈钢制作 检测系统：灵敏度高、噪音低、线性范围宽、响应快、死体积小 两种类型：溶质型检测器、总体检测器 附属系

2、统,进样阀,样品,装样,废液,淋洗液,至分离柱,定量环进样,（）,（）,样品环,梯度洗脱装置,外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。 内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,1 分离系统 固定相：主要是微粒硅胶、高分子微球和微粒多孔碳 正相色谱与反相色谱？ 流动相又分为冲洗剂、洗脱剂或载液，要求粘度小、沸点低、固体残留物少、与检测器相适应、于色谱系统的适应性。 色谱柱：大致分为三种类型，微管柱、细管柱、制备柱。 色谱柱的装填有干法和湿法两种。,2 检测器的类型 紫外-可见分光光度

3、计，通用 示差折光检测器，通用，原则上凡是与流动相的折射指数有差别的样品都可用它来测定 荧光检测器：极高的灵敏度和良好的选择性 电化学检测器：电导、库伦、安培、电位，灵敏度较高。 化学发光检测器：高选择性、高灵敏度 质谱检测法 Photodiodearray（PDA）,三、 离子交换色谱和离子色谱 适宜分离离子化合物、有机酸、有机碱等能电离的化合物和能与离子基团相互作用的化合物 1 基本原理 柱填料是一种带电荷官能团的固定基质。带负电荷，阳离子交换剂；带正电荷，阴离子交换剂 样品离子和离子交换树脂上带固定电荷的活性交换基团之间发生离子交换，由于不同样品离子对于离子交换树脂的亲和力不同，即互作用

4、强度不同，与树脂作用弱的溶质不易保留，首先从柱中被冲洗下来，而与树脂作用强的溶质则较长地保留在柱中，较晚地被冲洗出来。 通过控制流动相中反离子的浓度、离子强度和离子类型，可调整被分析组分的k值，从而获得好的选择性和柱效。,离子色谱的基本流程图,淋洗液,泵,色谱柱,检测器,泵液,分离,检测,记录,进样阀,抑制器,检测池,进样,2 固定相 合成树脂、纤维素和硅胶。 经典的离子交换树脂主要是聚苯乙烯和二乙烯基的苯交联聚合物，有微孔型和大孔型之分。主要缺点是在水和有机溶剂中容易发生膨胀，造成传质速度慢，难以实现快速分离。 薄膜型和多孔型的树脂，传质速度快、柱效高，快速分离，但负荷低。 硅胶类的离子交换

5、剂，机械性能稳定，可快速分离，但化学稳定性差，只适宜于小范围pH。,3 流动相 Na2CO3、NaHCO3。 通过改变流动相中反离子的种类、浓度及pH值等来控制k值，改变选择性。 流动相的浓度对溶质的保留时间有很大影响。 4 离子色谱 双柱离子色谱（抑制柱离子色谱） 单柱离子色谱（非抑制柱离子色谱） 双柱离子色谱 ：分离柱与电导检测器之间增加一根抑制柱，柱中填充的离子交换树脂所带电荷与分离柱相反。经分离后的流出液首先通过抑制柱，进行抑制反应，除去洗脱剂中离子，再进入电导检测器检测，获得扣除流动相背景的电导值。,双柱法的优点是降低了流动相的总离子含量，提高检测试样离子的灵敏度。其缺点在于，抑制柱

6、必须再生，并且由于抑制柱的存在而使色谱峰展宽，导致分辨率下降。 单柱离子色谱: 只有一根分离柱，不用抑制柱，故流动相直接由分离柱流到电导检测器。单柱离子色谱法因减少了抑制柱带来的死体积，分离效率高。单柱离子色谱法的主要缺点是难以在高电导介质中测量低含量试样离子。,分离阴离子,Column ： IonPac AG12A / AS12AEluent ： 2.7mM Na2CO3 0.3mM NaHCO3Flow rate： 1.2mL/min Detection： Conductivity (ASRS Recycle mode),0,2,4,6,8,10,12,14,16,Retention ti

7、me(min),0,8,mS,4 Capillary Electrophoresis (CE) & Microchip Capillary electrophoresis(MCCE),毛细管电泳（Capillary Electrophoresis, CE)诞生20多年来，发展迅速并日渐成熟。 毛细管电泳的特点： 1、快速 1min30min 2、高效 10万100万 3、耗样量少 nL 4、易于自动化,一、基本概念和原理,电泳（Electrophoresis）：带电离子在电场作用下的迁移，速度电泳 电渗流（Electroosmosis flow）：玻璃表面存在硅羟基, pH3时, 形成双电层，

8、在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，速度电渗流,Zeta电位：剪切面（shear plane）所具有的电位称为Zeta电位。Zeta电位正比于扩散层厚度和单位面积过剩电荷总数。 表观电泳速度:电渗和电泳速度的叠加值。,焦耳热：电流通过毛细管内离子导体（电泳缓冲液）时，会产生热量。焦耳热是造成基线漂移、峰展宽的重要原因。 迁移时间tl/v=l/uE=lL/Uu Rs、N基本表达式同其它色谱 电泳谱图（electropherogram）：分析物中各组分迁移顺序和结果的表示。,带电粒子在外加电场下，由于其淌度(在胶束电动毛细管色谱中还有分配系数)不同，它们具有不同的迁移速度，经过一定的时间

9、，会分离开来，这就是毛细管电泳的基本原理。 Fe=qE Fd=kv 对球状粒子，k=6r v=qE/(6 r) N=（+EOF）V/2D R=vN0.5/4v,方法分类,1、毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis, CZE） 2、毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis, CGE） 3、胶束电动毛细管色谱（micellar electrokinetic capillary chromatography, MECC） 4、毛细管等速电泳（capillary isotachophoresis, CITP） 5、毛细管等电聚集（

10、capillary isoelectric focusing, CIEF）,MECC,CITP,CGE&CITP,二、仪器构成,1、高压电源 0-30kV,极性可换，电流一般小于100微安 直流 n=uEl/2D,2、电极和毛细管,电极：一般为铂电极，多用50、75、100微米直径铂丝 毛细管：熔融石英毛细管（fused silica），常用长度一般为40100cm，内径25、50、75、100居多，外径通常为365微米,检测器,光学检测器、电化学检测器、质谱（MS）检测器和折光指数检测器四类 光学检测器最常用，包括紫外、荧光、激光诱导荧光检测器,Separation of seven PSPs with CZE and CITP/CZE,进样（Injection）,1、流体动力学进样（hydrodynamic injection） ：包括虹吸进样（压差进样），压入和吸入3种 2、电动进样： 在实际操作中，通常将样品塞长度限制在毛细管总长的1左右,缓冲液/背景电解质,要有一定的缓冲容量 大多为水溶液 浓