细胞生物学技术

1、第三章 细胞生物学研究方法,Chapter 3 Techniques in Cell Biology,第一节 显微技术,细胞生物学的建立和发展得益于光学显微镜的发明； 电子显微镜的发明使对细胞结构和功能的研究达到了新的水平。,光学显微镜与电子显微镜的主要差别在所使用的光源不同，但分辨率却相差非常大： 光学显微镜的最大分辨率：0.2m 电子显微镜的分辨率：0.2nm,一、显微镜的成像原理,所有类型的显微镜，镜像的形成都需要3个基本要素： 1、照明系统； 2、被观察的物品； 3、聚焦成像的透镜系统,照明系统的波长是显微镜成像的重要因素，因为波长能决定被检测物体的最小极限，波长越长，波幅的跨度就越大

2、，所能观察到物体的极限就越大。,1、分辨率（Resolution）,是指能分辨出相邻两个物点间的最小距离的能力。 一般规定：显微镜或人眼在25cm明视距离处，能清楚分辨被检物体细微结构最小间隔的能力，称分辨率。,分辨力可用公式计算： R=0.61 /N.A. N.A.sin 式中： =波长；n=介质折射率；=镜口角（标本对物镜镜口张角的1/2），N.A.=镜口率（numeric aperture）。镜口角总是要小于90，sin 的最大值小于1。,不同光源的波长,2、最大分辨率,R值越小，分辨率越高，即需要尽可能地小，和N.A.尽可能大。 可见光中以蓝光波长最短， =450nm； 目前最好的玻璃

3、透镜的=70 ， sin =0.94; 空气的折射率n1； 所以光镜的最大分辨率： R=450/1*0.94=292nm=0.3m,3、分辨极限与放大率,显微镜的最大分辨率即是它的分辨极限。 最终成像的大小与原物体大小的比值称为放大率（magnification）。 总放大率=物镜的放大率*目镜放大率 放大率受分辨极限的限制。一般，光学显微镜的最大放大率只能是数值孔镜（N.A.）的1000倍。,二、光学显微镜,（一）、普通双目显微镜 *照明系统：可见光源 *光学放大系统：由物镜和目镜组成，都是由玻璃透镜组构成；在物镜上方装有4个棱镜，使物镜的光线平分为两路到达目镜 *机械和支架系统：保证光学系

4、统的准确配制和灵活调控,1. The Light Microscopy（LM）,光镜观察样本的制备,取材固定脱水包埋切片脱蜡复水染色脱水透明封片观察,石蜡切片.,2、倒置显微镜,组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，普通显微镜在载物台之下，倒置显微镜在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。,3、暗视野显微镜（dark field microscope）,聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 能观察 4200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。,4、荧光显微镜,是对能发荧光的物质进

5、行定性和定量研究的工具。 细胞中有些物质如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光； 有些物质本身虽不能发荧光，但用荧光染料染色，紫外线照射也发荧光。,荧光显微镜和普通显微镜区别：,1、照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上； 2、光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 3、有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。,5、激光共聚焦扫描显微境（laser confocal scanning microscope）,*用激光作光源，逐点、逐行、逐面扫描成像，激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。 *

6、调焦一次，扫描限制在样品一个平面。调焦深度不一时，可获样品不同层次图像，经计算机模拟，能显示样品的立体结构。 *激光波长短，光束细，分辨率是光镜的3倍。,Comparison of conventional and confocal fluorescence microscopy. These two micrographs are of the same intact gastrula-stage Drosophila embryo that has been stained with a fluorescent probe for actin filaments. The conventi

7、onal, unprocessed image (A) is blurred by the presence of fluorescent structures above and below the plane of focus. In the confocal image (B), this out-of-focus information is removed, which results in a crisp optical section of the cell in the embryo.,6、相差显微镜（phase-contrast microscope）,由Zernike于19

8、32年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。 最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。,基本原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差（明暗差），从而提高了各种结构间的对比度，使结构变得清晰可见。 光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4，如再增加或减少1/4，则光程差变为1/2，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减小，提高反差。,构造上，相差显微镜不同于光镜之处： 1、环形光阑（annular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 2、相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将

9、直射光或衍射光的相位推迟1/4。,Figure 3-2. Interference between light waves. When two light waves combine in phase, the amplitude of the resultant wave is larger and the brightness is increased. Two light waves that are out of phase partially cancel each other and produce a wave whose amplitude, and therefore bri

10、ghtness, is decreased.,7、微分干涉显微镜（differential-interference microscope）,1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明。 优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，标本可略厚，折射率差别更大，故影像立体感更强。,图2-10 DIC显微镜下的硅藻（伪彩色）,DIC显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。,四种类型显微镜对成纤维细胞观察效果的比较： (A) 明视野显微镜； (B) 相差显微镜；

11、(C) 微分干涉显微镜； (D) 暗视野显微镜,二、电子显微镜,光学显微镜受照射光波长的限制，在可见光下其分辨极限只有0.2m，即使在紫外光下，最大分辨率也只有0.1 m，要观察更精细的结构，只有借助分辨率更高的电子显微镜。,（一）透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM),Ruska 1932年发明。 以电子束为光源，波长比可见光和紫外光短得多，且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比。 最大分辨率达0.2nm。,1、透射电镜的结构,由5部分组成： 1、电子照明系统：电子枪； 2、真空系统：用真空泵和油扩散泵获得高真空； 3、电磁透镜成像系

12、统：规范电子的行为； 4、记录系统：用荧光屏观察影像，用照相系统记录影象； 5、电源系统：提供高压稳压。,2、电镜制样技术,（1）超微切片技术,石蜡切片: 3-10um; 超薄切片: 40-50nm,Sections of LM: 5um; Sections of TEM: 100nm,由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机（ultramicrotome）制作。,Thin sections,copper grid used to support the thin sections of a specimen in the tran

13、smission electron microscope.,Specimen Preparation for Electron Microscopy,Two common chemical fixatives used for electron microscopy. The two reactive aldehyde groups of glutaraldehyde enable it to cross-link various types of molecules, forming covalent bonds between them. Osmium tetroxide is reduc

14、ed by many organic compounds with which it forms cross-linked complexes. It is especially useful for fixing cell membranes, since it reacts with the C=C double bonds present in many fatty acids.,Electron micrograph of a root-tip cell stained with osmium and other heavy metal ions. The cell wall, nuc

15、leus, vacuoles, mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and ribosomes are easily seen.,通过连续切片达到被检样品的三维结构的重构,（2）负染色技术,负染是用重金属盐（磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色； 吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，呈负染效果，分辨力可达1.5nm。,经负染的肌动蛋白纤维,(3)冰冻蚀刻(freeze-etching),样本置-196C液氮中冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，冰在真空下迅速升华，暴露出断面结

16、构，称蚀刻。 蚀刻后，向断面喷涂一层铂和碳，加强反差和强度。再用次氯酸钠溶液消化样品，剥下碳和铂的膜，即复膜。复膜代表标本蚀刻面的形态，电镜下的影像即代表标本断面的结构。,（二）扫描电镜（Scanning electron microscope (SEM),*问世于20世纪60年代； *用来观察标本的表面结构。 *扫描电镜的分辨力为610nm，最大有效放大倍率为20000X。,工作原理,*用细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品的表面结构有关。 *次级电子由探测器收集，转为光信号，再经光电倍增管和放大器转为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示扫描图像。图像为立体，

17、显示标本表面结构。,为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。,培养中的小鼠成纤维细胞扫描照片,三、扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope,STM),Binnig等1981年发明，根据量子力学原理中的隧道效应而设计。 Binnig等因此获得1986年诺贝尔物理学奖。,（一）工作原理,当原子尺度的针尖在不到一纳米的高度扫描样品时，此处电子云重叠，外加2mV2V电压，针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。电流强度和针尖与样品间的距离有函数关系。 样品表面原子凹凸不平，使探针与

18、物质表面间的距离不断改变，致电流改变。将改变的电流图像化即可显示出原子水平的形态。,（二）主要特点,1、分辨率高，横向为0.10.2nm，纵向可达0.001nm； 2、可在固态、液态和气态下进行观察； 3、非破坏性观察。,四、原子力显微镜(atomic force microscope, AFM),* Binning在STM基础上发明。 * 特点：不要求样品是导电体。 * 原理：针尖安装在灵敏的悬臂上，当针尖原子与样品表面原子间的原子力变化时，悬臂发生偏移，通过激光可测出，并扫描出原子水平的结构图像。,第二节 细胞分离技术,一、离心技术,离心是研究各种细胞器和大分子基本手段。 高速离心机：转速

19、为1025Kr/min； 超速离心机：转速超过25Kr/min，离心力大于89K。,(一)差速离心(differential centrifugation),*在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，分离不同大小的细胞和细胞器。 *差速离心中细胞器沉降的顺序：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、核糖体。,速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀,(二)密度梯度离心(density gradient centrifugation),1、速度沉降:用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 2、等密度沉降:适用于分离密度不等的颗粒。,二、细胞电泳(cell electrophoresis),

20、*一定pH下，细胞表面带正或负电，可在外加电场下发生泳动。 *各种细胞带电量不同(电位)，在一定电场中的泳动速度不同。通过测定电泳速度可推算出细胞的电位。 *电位常因细胞生理和病理状态而异，在诊断疾病上有一定价值。,第三节 细胞组分分析方法,揭示细胞内生物大分子物质的功能及其相互间的关系。,一、细胞化学技术,利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究。 能显示蛋白质、核酸、酶、糖类、脂类、无机物等。,1、Schiff反应(Feulgen反应),细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。常用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。,2、金属沉

21、淀法,利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。,Electron micrograph of a cell showing the location of a particular enzyme (nucleotide diphosphatase) in the Golgi apparatus. A thin section of the cell was incubated with a substrate that formed an electron-dense precipi

22、tate upon reaction with the enzyme,3、脂染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 4、茚三酮反应：显示蛋白质。 5、联苯胺反应：过氧化物酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝，变成棕色化合物。,二、免疫细胞化学 （immunocytochemistry）,*根据免疫学原理，利用抗体同抗原特异性结合，对抗原进行定位。 *将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原反应，可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于细胞或组织中的部位。,1、免疫荧光法(immunofluorescent technique) 采用荧光素（异硫氰酸酯、罗丹明）标记。将荧光色素

23、同抗原或抗体结合，然后使其与组织切片或细胞涂片标本中各个相对应的抗体或抗原结合，用荧光显微镜检查其定位的方法 免疫荧光法有直接法和间接法（sa-ndwich法）。直接法依靠荧光抗体与抗原或荧光抗原同抗体的结合；与此相反，间接法首先使抗原（抗体）结合相对应的抗体（抗原），然后让那种抗体（抗原）与相对应的荧光抗原（抗体）结合。,2、酶标免疫法(enzyme-labeled antibody method) 采用酶（辣根过氧化物酶）标记，酶与底物反应后形成不透明的沉积物，显示出抗原存在的部位。 3、免疫电镜技术：用重金属标记，如胶体金,免疫电镜照片：抗体用胶体金颗粒标记. 显示胰岛素分泌细胞中胰岛素

24、的存在部位和方式。,三、放射自显影术(radioautography),*用于研究被标记化合物在组织和细胞中的分布及动态。 *原理：将放射性同位素(14C和3H)标记的化合物导入生物体内，将标本制成切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。经显影显示黑色银颗粒，即可知标本中标记物的位置和数量。 *这种技术与电镜结合，则为电镜放射自显影术。,电镜放射自显影照片： 胰腺细胞饲喂含 3H的亮氨酸 5分钟，这种氨基酸大部分都被合成胰岛素。黑色银颗粒显示，胰岛素最初出现在内质网，10分钟后被运到高尔基体 (A), 45分钟后它出现在分泌小泡中。 (B).,四、分子杂交技术(molecular hy

25、bridization),* 是在DNA分子变性和复性基础上发展起来的一种技术。 * 原理：具互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子，适宜条件下，可结合形成DNA-DNA，DNA-RNA或 RNA-RNA杂交的双链分子。 * 可测定单链核苷酸间序列有否互补。,(一)原位杂交(in situ hybridization),用来检测染色体上的特殊DNA序列。 1、带放射性DNA探针； 2、免疫探针法,（二）Southern杂交,*是体外分析特异DNA序列的方法。 * 先用限制性内切酶将DNA切成片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用标记的探针杂交，辨认出与探针互补的特殊核苷序列。,五、定量

26、细胞化学技术,（一）显微分光光度测定技术 细胞中有些成分具特定的吸收光谱，如核酸的吸收波长为260nm，蛋白质为280nm。 根据细胞成分的这种特性，可用显微分光光度计对某些成分进行定量测定。,（二）流式细胞术（flow cytometery）,*对单个细胞进行分选与定量分析。 *原理：对待测成分染色或抗体标记，用鞘液的液滴包裹单个细胞，在激光束照射下，细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，依据电信号进行分选。 *所用仪器为流式细胞仪。分离纯度达99%。,第四节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术,一、细胞培养（cell culture）,*高等生物由多细胞构成，整体条件下要研究单个

27、细胞或某群细胞在体内的活动、功能很困难。把活细胞进行体外培养观察研究，方便得多。 *细胞培养就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养的技术。,（一）动物细胞培养,1、群体培养(mass culture):将含一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层； 2、克隆培养(clonal culture)，将高度稀释的细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，经生长增殖每个细胞形成一个细胞群落，称为克隆（clone）。,群体培养（左）和克隆培养（右）,原代培养 （primary culture）：从动物机体取出的进行培养的细胞群。原代培养的细胞生长较缓慢，且繁殖一定代数后(一般10代)停止生长，需更换培养基。 传代培养（Passage）：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶。,（二）植物细胞培养,1、组织培养：诱发愈伤组织，培养再生植株。 2、细胞悬浮培养：愈伤组织培养基础上发展起来。制取植物代谢产物。 3、原生质体培养：诱导分化成植株；易进行遗传转化；进行细胞融合； 4、单倍体培养：花药或花粉培养获得单倍体植株，人工加倍后可得纯合个体。,二、细胞工程(cell engineering),按照人类的需要或愿望，采用工程学手段，对细胞进行遗传改造的技术。,（一）细胞融合 （cell