RNA的生物合成.ppt

1、上海市精品课程系列-生物化学,第四章RNA的生物合成,第四章 RNA的生物合成,4.1 概述,以DNA分子中一条链的部分片段为模板，按照碱基配对原则，按53方向合成出一条与模板DNA链互补的RNA分子的过程。,4.1 概述,转录的部位,真核生物：细胞核 原核生物：核质区,核仁：rRNA 核质：mRNA，tRNA,原料：NTP 模板：DNA 酶：RNA聚合酶 其它蛋白质因子,参与转录的物质,4.1 概述,转录的反应,酶,模板,4.1 概述,不对称转录：转录区只有一小段DNA的一条链作为模板链进行转录。,4.1 概述,模板链（反义链、负链）：可作为转录模板的DNA的一条链，与转录的RNA反义，编码

2、链是针对某一基因而言。,编码链（有义链、正链）：不参与转录的DNA的一条链，其序列与转录的RNA相同，只是编码链中的T在RNA中为U。,4.1 概述,模板链不固定在DNA的某一条链上，而是两条链中交互出现，使转录也交替出现。,转录单位：DNA链上从启动子直到终止子为止的序列。一个转录单位包括一个或几个基因。,4.1 概述,4.1 概述,4.2 原核生物RNA的合成,RNA聚合酶,特点,以DNA为模板 都以四种三磷酸核苷为底物和原料 都遵循DNA与RNA之间的碱基配对原则 RNA链的延长方向是53的连续合成 需要Mg2+或Mn2+离子 不需要引物 缺乏35外切酶活性,4.2 原核生物RNA的合成

3、,大肠杆菌RNA聚合酶,启动子,a2bbs（全酶） = a2bb（核心酶） + s,识别DNA上转录起始信号的碱基序列（启动子）,与启动子结合，决定哪个基因被转录,与DNA模板结合,催化磷酸二酯键的形成，与转录全过程有关,4.2 原核生物RNA的合成,利福平和利福霉素可与b亚基结合，阻止RNA链的延伸，从而抑制转录的发生。,肝素是一种多价阴子化合物，能与b亚基结合，从而在体外抑制转录作用。,s70：转录大多数基因,4.2 原核生物RNA的合成,启动子,结构,4.2 原核生物RNA的合成,RNA聚合酶识别和结合的DNA上一段特殊的核苷酸序列，位于转录起点附近。,RNA聚合酶与启动子的结合,4.2

4、 原核生物RNA的合成,RNA聚合酶能与-35和-10区中的碱基及DNA主链中的磷酸基相接触；与保守序列差别较远的启动子活性较弱；破坏启动子功能的突变中有75%是改变了保守序列中的碱基，其余25%为离保守序列较近的。,s因子与启动子,4.2 原核生物RNA的合成,s因子结构的不同区域分别参与了和编码链的接触、熔链反应以及与核心酶相互作用。-35区作为启动子的识别域，-10区为“解链域”。,s70被证明其Tyr425、Tyr430、Trp433、Trp434等四个氨基酸残基直接与启动子-10区的TATAAT序列作用，解开DNA双螺旋。,启动 起始 延伸 终止,4.2 原核生物RNA的合成,4.2

5、 原核生物RNA的合成,转录的启动,由RNA聚合酶全酶结合于启动子而被启动，形成闭合二元复合物。,4.2 原核生物RNA的合成,转录的起始,局部解链 （约17个碱基对）,第一个核苷三磷酸结合到全酶上,第二个核苷三磷酸参入，形成第一个磷酸二酯键,s因子从全酶上掉下，核心酶在DNA链上向下游滑动,开放二元复合物,链的延伸,4.2 原核生物RNA的合成,转录的终止,4.2 原核生物RNA的合成,终止子： DNA分子上一段终止转录的特殊核苷酸序列。,终止依赖于RNA产物，而不是由转录中DNA序列来决定。,依赖r因子的终止,不依赖r因子的终止,4.2 原核生物RNA的合成,共同序列特征：在转录终止前有一

6、段回文结构，之间由几个碱基隔开，因此转录的RNA片段会形成茎环结构，阻止聚合酶前进。,4.2 原核生物RNA的合成,不依赖r因子的终止,4.2 原核生物RNA的合成,依赖r因子的终止,r因子：活性形式为六聚体，亚基具有一个RNA结合域和ATP水解域。六聚体具有依赖ATP的解旋酶活性。,4.3 真核生物RNA的合成,4.3 真核生物RNA的合成,与RNA聚合酶II特异性结合，从而抑制磷酸二酯键的形成。用于真核细胞RNA聚合酶的识别或RNA聚合酶II的定量等。,真核RNA聚合酶,4.3 真核生物RNA的合成,真核启动子,TATA盒决定转录起点的选择。,CAAT盒与转录起始频率有关。,4.3 真核生

7、物RNA的合成,增强子能增强启动子的活性，可存在于启动子上游或下游。,4.3 真核生物RNA的合成,转录的起始,转录因子可与RNA聚合酶II形成转录起始复合物，共同参与转录起始过程。,4.3 真核生物RNA的合成,TFIID能与启动子结合，并吸引其它转录因子及聚合酶进到转录启动区。,4.3 真核生物RNA的合成,转录的终止,RNA聚合酶II所转录的基因在最后一个外显子下游都具有一个加poly-A的信号AATAAA序列，而RNA聚合酶II一般在该位点下游停止转录。,4.4 转录后加工及其机制,4.4 转录后加工及其机制,mRNA,原核生物的结构基因是连续编码序列，转录形成的mRNA绝大数不需加工

8、修饰。原核生物没有核膜，转录和翻译是偶联的，往往转录还未完成已开始翻译。,rRNA,4.4 转录后加工及其机制,7个编码rRNA的操纵子分散于基因组中，组成基本相 同，均含有16S-23S-5S的三个rRNA分子。 16S rRNA后有1-2个tRNA基因，23S和5SrRNA后有0、 1或2个tRNA基因。,4.4 转录后加工及其机制,rRNA在修饰酶催化下进行碱基的甲基化修饰； rRNA前体被RNase III、RNase E、RNase P、RNase F等 剪切成一定链长的rRNA分子； rRNA与蛋白质结合形成核糖体的大、小亚基。,tRNA,4.4 转录后加工及其机制,tRNA前体被

9、tRNA剪切酶切 成一定大小的tRNA分子； 成熟tRNA分子中的稀有碱基 是通过修饰形成的； 3-末端加上CCA。,4.4 转录后加工及其机制,mRNA,真核mRNA被合成达到20-40bp时就开始进入加工阶段。,4.4 转录后加工及其机制,5-端加帽 3-端加尾 甲基化 剪接,4.4 转录后加工及其机制,5-端加帽,是翻译起始所必要的，为核糖体 识别mRNA提供了信号； 协助核糖体与mRNA结合使翻译 从AUG开始； 增加mRNA稳定性，免遭5外切 核酸酶的降解。,RNA三磷酸酶 mRNA鸟苷酰转移酶 mRNA（鸟嘌呤-7）甲基转移酶 mRNA（核苷-2）甲基转移酶,4.4 转录后加工及其

10、机制,帽子0：7-甲基鸟苷以5-5三磷酸键与RNA的5-端相连形成m7GpppN。,帽子1：RNA的第1位核苷酸的2-O位也甲基化，形成m7GpppNm。,帽子2：RNA的第1、2位核苷酸的2-O位均甲基化，形成m7GpppNmNm。,4.4 转录后加工及其机制,3-端加尾,3端AAUAA、YGUGUGYY（Y为嘧啶）序列作为mRNA 3-端加polyA尾的信号。,RNaseIII在加尾信号下游11-30bp处切断磷酸二酯键。,polyA聚合酶催化在3-OH上逐一引入100-250个A。,防止核酸外切酶降解mRNA信息序列，可能与mRNA的运输有关。,4.4 转录后加工及其机制,甲基化,真核m

11、RNA往往有甲基化位点，主要是在N6-甲基腺嘌呤（m6A）。这种甲基化修饰对翻译没有必要，可能在mRNA前体加工中起识别作用。,4.4 转录后加工及其机制,剪接,内含子的切除 外显子的拼接,成熟mRNA 单顺反子,4.4 转录后加工及其机制,GU-AG规律：所有内含子都是以GU开始，以AG告终的保守序列。,mRNA前体的内含子末端序列剪接位点突变引起剪切错误，剪切位点突变导致地中海贫血症。,4.4 转录后加工及其机制,U系列snRNA与蛋白质结合形成核糖核蛋白颗粒（RNP）。U-snRNA参与hnRNA的剪接过程，U1、U2、U4、U5、U6可能都与hnRNA的加工有关。,snRNP和其他辅助

12、蛋白共同组成一个剪接体，对内含子3和5剪接位点和分支点进行识别和剪接作用。,4.4 转录后加工及其机制,mRNA前体在snRNP等参与下，内含子中分支点部位的腺苷酸残基的2-OH自动攻击内含子5端与外显子1连接的磷酸二酯键，切下外显子1。,腺苷酸原来的3,5-磷酸二酯键依然存在，加上此2,5-磷酸二酯键连接后，在腺苷酸处出现了一个套索。,已被切下的外显子1的3-OH攻击内含子3-端与外显子2间的3,5-磷酸二酯键使其断裂，内含子以套索的形式被切下。外显子1和2相互连接。,rRNA,4.4 转录后加工及其机制,真核生物rRNA基因有几十至几千个拷贝数串联重复。其中18S rRNA、28S rRN

13、A和5.8S rRNA基因成簇排列组成一个转录单位，彼此被间隔区分开，由RNA聚合酶I转录成一个rRNA前体。,4.4 转录后加工及其机制,5S rRNA基因也成簇排列，存在于另一个转录单位，间隔区不被转录，由RNA 聚合酶III转录（内部启动子）。,4.4 转录后加工及其机制,甲基的存在是初级转录物转变成熟的rRNA的标志。,4.4 转录后加工及其机制,人类的45S rRNA与小鼠的45S rRNA加工方式不同。,酵母rRNA加工途径,tRNA,4.4 转录后加工及其机制,tRNA基因成簇排列，被间隔区分开，由RNA聚合酶III转录。 真核生物转录生成的tRNA前体需进行加工修饰才有生物活性

14、。,tRNA的剪接需要独立的核酸酶和连接酶活性。由内切酶保证内含子识别的专一性，在内含子两个末端进行tRNA的剪接。,4.4 转录后加工及其机制,核酸内切酶切断内含子- 外显子边界，产生2-3- 环形磷酸和5-OH； 环形磷酸打开产生2-磷 酸和3-OH，5-OH末端 磷酸化； 内含子释放， tRNA半 分子折叠成一个含5-磷 酸及一个3-OH 裂口的 类tRNA结构； 连接酶缝合裂口，磷酸 酶除去2-磷酸； 碱基修饰； 3-OH连接CCA结构。,ACC,4.4 转录后加工及其机制,主要存在于核中，化学本质是RNA； 大小从十几个bp到数百个bp； 底物多为RNA（也有DNA、糖类、氨基酸酯等）； 催化效率较酶（蛋白质）低得多； 必需有Mg2+存在； 具有催化作用的专一性； 作用方式有剪切型和剪接型两大类型，称为自我剪切 和自我剪接。,核酶的特性,4.4 转录后加工及其机制,相当于核酸内切酶和连接酶两种酶的联合作用，催化自身RNA进行剪切和连接。,剪接型核酶,催化反应需Mg2+和鸟苷或5鸟苷酸参与，鸟苷必须有游离的3-OH，剪下来的内含子生成环状中间产物。,成熟rRNA,4.4 转录后加工及其机制,4.4 转录后加工及其机制,相当于核酸内切酶，可催化自身RNA或异体RNA切除一段特异的核苷酸序列。,剪切型核酶,RNase P由蛋白质和miRNA组成； miR