第1章 抗体.ppt

1、第一章 可溶性免疫分子-免疫球蛋白Immunoglobulins(Ig),概念,抗体（antibody.Ab ） 是B细胞识别抗原后分化为浆细胞产生的与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白（蛋白质），存在于血清等体液中。 免疫球蛋白（immunoglobulin.Ig ） 指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白，可分为分泌型SIg和膜型mIg。前者存在于体液中，即抗体，后者存在于B细胞膜上， 即BCR,抗体的分子结构,基本结构： Y型结构 由两条相同的重链及两条相同的轻链以-S-S-相连的四肽链结构。,50-70KD，450-550个AA组成 分成五类，相应的Ig也分为五类。 H： Ig

2、： IgA IgG IgM IgD IgE,H链：,同一类Ig据其铰链区的aa组成及重链二硫键数目将Ig分为不同的亚类。,亚类：,L链： 25KD，214个AA组成 、型，功能相似，每个Ig两条L链的型别总是相同的。 据种属不同，其：比例不一（人为2：1，小鼠为20：1） 型有4个亚型,V区(variable region )、C区(constant region),高变区（hypervariable region,HVR）：V区中某些区域aa组成和排列变化更大，VH、VL 各有3个区域，分别用HVR1、HVR2、HVR3 表示，共同组成与抗原结合的表面，故又称为互补决定区（complemen

3、tarity-determining region,CDR），包括CDR1、CDR2、CDR3。,结构域 (domain) 铰链区（hinge region),VH、VL：抗原结合部位 CH1、CL：遗传标志所在 CH2：补体结合位点 IgG通过胎盘 CH3：与组织细胞上 Ig受体结合,结构域,Ig折叠(Ig fold),每个结构域约由110个氨基酸组成，二级结构是由几股多肽链折叠形成的两个反向平行的片层( -pleated sheet)，两个片层中心由链内二硫键垂直连接，形成“桶状”或“三明治”结构。这种折叠方式称为免疫球蛋白折叠。,免疫球蛋白的其他成分,J链 jioning chain由浆

4、细胞合成富含半胱氨酸的多肽链，主要是将单体Ig分子连接为多聚体。 分泌片 secretory piece,sp由粘膜上皮细胞合成和分泌的一条含糖肽链，为分泌型IgA产生所必需，可保护sIgA免受蛋白酶的水解破坏，并介导IgA的转运。,IgM,SIgA,免疫球蛋白的水解片段,木瓜蛋白酶水解IgG 胃蛋白酶裂解IgG,木瓜蛋白酶,胃蛋白酶,铰链区H链二硫键的近N端处 Fab2(L链+H链的VH和CH1)，可与Ag结合单价 Fc 2条H链CH2+CH3 同种型抗原性存在于此,铰链区H链二硫键近C端 F（ab）2双价与Ag结合 PFC 大分子片段，失去活性,免疫球蛋白的生物合成、表达与代谢,合成与组装

5、,地点：淋巴组织,浆细胞,粗面内质网,滑面内质网,高尔基体,细胞膜,免疫球蛋白的表达,前B细胞表达IgM 成熟的B细胞表达IgM、 IgD 接受抗原刺激的B细胞活化，分泌型的Ig增多，膜型Ig减少,免疫球蛋白的生物合成与组装,重链V区基因由三种胚系基因片段：V、D、J拼接而成 轻链V区基因由V、J两个基因片段拼接成的 V区基因的下游是编码C区的基因,胚系基因通过一组酶的作用，包括识别位于V、（D）、J基因片段两侧的保守序列（重组信号序列），切断以及修复DNA，达到剪去胚系基因片段之间的内含子， 连接形成完整BCR/Ig编码基因。 B细胞成熟过程中，在DNA水平，V区基因发生重排，从V、D、J基

6、因节段库中，各选择出一个节段先进行D-J连接，然后进行V-D连接，或V-J连接,在RNA （转录）水平，V区基因与C区基因进行剪接形成完整的编码一条肽链的mRNA 以mRNA为模板翻译合成H链/L链、链/链组装成BCR/TCR，表达于细胞表面,等位基因排斥：指B细胞中位于一对染色体上的轻链或重链基因，其中只有一条染色体上的基因得到表达。保证一个B细胞只表达一种轻链和一种重链。 同种型排斥：指轻链和轻链之间的排斥，一个B细胞只能表达其中一种链或链。,I Ig重链V区基因重排,轻链基因的重排 Ig轻链基因的重排,h,I Ig重链C区基因重排,重排时，基因片段和七聚体之间被切断，从而使两个基因片段连

7、接，两基因片段之间的序列，连成环被切除，称为环出。,七聚体一间隔序列（12/23bp）一九聚体结构。带12bp的RSS基因片段只能和带23bp的RSS片段结合，称“12-23”规则，这样保证了片段连接的准确性,重排与重组信号序列 （RSS ）,环出,V区多样性产生原因,组合造成的多样性 连接造成的多样性 体细胞高频突变造成的多样性,膜型Ig和分泌型Ig重链基因,发生时间：在转录加工中造成 由两个外显子决定（SC分泌型、MC膜型） 在转录时，若是转录到SC，则为分泌型Ig。 若包括MC，而将SC剪切掉，则为膜型Ig。,抗原激活B细胞后，膜上表达和分泌的Ig类别会从IgM转换成IgG、IgA、Ig

8、E等其它类别或亚类的Ig，即Ig的V区不变C区发生转换，这种现象称Ig类别转换。,指在抗体应答过程中，特别是再次免疫后抗体的亲和力升高的现象。主要是由抗原在生发中心中对高频突变的B细胞选择的结果。,免疫球蛋白的异质性,抗体V区的异质性,不同抗原表位- Ig的特异性不同，构成Ig 的多样性,抗体C区的异质性,将Ig作为抗原在异种、同种异体或自身体内进行免疫，均能诱导机体产生特异性免疫应答。即使针对同一抗原表位- Ig的特异性相同，C区可不同,类 亚类 型 亚型,同种型(isotype) 指同一种属所有正常个体Ig分子所共有的抗原特异性标志，主要存在于Ig的C区中，据H链C区的不同又分为五个大类，

9、每一类又分若干亚类；按L链的不同分为两型，每型又分为若干亚型。,同种异型（allotype) 同一种属中不同个体所产生的同一类型Ig,由于重链或轻链恒定区内一个或数个氨基酸（即遗传标志）不同而表现的免疫性差异,独特型（idiotype) 同一个体中不同B细胞克隆所产生的Ig可变区所具有的抗原特异性标志，由Ig超变区特有的氨基酸序列和构型所决定。,独特型可刺激异种、同种异体以及自体产生相应抗体，即独特型抗体（AId）,抗原刺激B细胞产生特异性抗体（Ab1),当数量足够大时， Ab1可以作为抗原在体内诱发抗抗体（ Ab2）的产生。抗抗体所针对的抗原表位只能是抗体分子上的独特型，因而Ab2称抗独特型

10、抗体。,分类： Ab2：针对Ab1 的骨架区邻近独特型。属于半Ag非抑制性Ab2 Ab2：针对Ab1 V区的CDR部位独特型，结构和Ag表位相似，因此被称为抗原内影像。 Ab2 ：针对Ab1 V区的CDR相关及邻近的独特型。属于半Ag抑制性Ab2，参与自身免疫病免疫抑制治疗 Ab2 ：既针对Ab1 的骨架区邻近独特型，又识别Ag表位，是双特异性抗体，与自身免疫病发生有关,独特型与抗独特型网络,免疫系统内所有抗体分子或淋巴细胞的抗原受体（TCR、BCR）上都存在着独特型，它能被体内另一类淋巴细胞所识别并产生抗独特型抗体（AId）。由Id-AId相互作用形成网络，并通过Id和AId的相互识别、相互

11、刺激和制约，对免疫应答进行调节。,应用抗原影像Ab2所具有的结构特点，模拟Ag，通过BCR增强对Ag的应答。 应用Ab2抑制Ab1，抑制自身反应性Ab或自身反应性T细胞的产生。,免疫球蛋白超家族,定义 与Ig 结构相似、遗传基因同源的，并具有识别和传递信号功能的蛋白分子统称为免疫球蛋白超家族（ IgSF ），通常存在于细胞表面。编码IgSF的基因称免疫球蛋白基因超家族。,免疫球蛋白超家族的组成,Ig TCR复合物、BCR复合物 MHC分子和MHC类样分子 CD4、CD8、CD2、CD28、CD80、CD86 IgFCR、 多聚IgR、某些细胞因子R,免疫球蛋白超家族分子的结构,胞外区：具有识别

12、功能，选择性接受微环境的刺激信号 跨膜区：具有锚定作用 胞内区：向胞内传递信号,免疫球蛋白超家族的生物学功能,识别、提呈Ag，引起特异性免疫应答 调节免疫细胞分化、增殖、及合成和分泌 介导细胞间黏附和信号传递，参与免疫细胞激活、分化与选择、移行、归巢与定居 参与Ig的转运与分泌,抗体的生物学功能与特性,V区的功能,C区的功能,激活补体,结合细胞表面Fc受体,穿过胎盘与粘膜,Ig的功能,体外,体内,分泌型,膜型,B细胞抗原识别受体,免疫诊断,中和毒素,中和病毒 ,调理作用,ADCC作用,介导型超敏反应,V区功能,特异性结合抗原 与Ag的结合具有高度特异性。 与抗原结合后，可介导体内的多种生理和病

13、理效应（中和病毒、毒素，介导炎症反应），体外可产生凝集、沉淀现象用于检测等。,二者的结合主要依靠静电引力、氢键、范德华力等，需要合适的温度、pH、离子强度以及完整的抗体，这种结合是可逆的。,免疫调节,超抗体活性,抗体可变区存在非经典活性部位，除与抗原结合外，还可与核苷酸及超抗原结合，兼具自身聚合作用及化学催化作用,C区功能 激活补体 当IgG13和IgM类抗体与抗原特异性结合后，其构型发生改变，暴露IgG的CH2和IgM的CH3功能域的补体结合位点，通过补体经典途径激活补体。,指抗体、补体促进吞噬细胞吞噬细菌等颗粒性抗原的作用，主要通过IgG的Fc与吞噬细胞上的 IgG Fc受体结合，从而增强

14、吞噬细胞的吞噬作用。,调理作用,抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用。指表达Fc受体的细胞（主要为NK、M、中性粒细胞）通过识别抗体的Fc段直接杀伤被抗体包被的靶细胞。,ADCC作用,介导型超敏反应,IgE的Fc的段可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的IgE Fc受体结合，促使这些细胞合成和释放生物活性物质，引起I型超敏反应。,穿过胎盘和黏膜 IgG所独有，是婴儿获得天然被动免疫的主要原因，主要借助胎盘滋养层细胞表面的FcR进行的。sIgA可通过呼吸道和消化道的粘膜，起粘膜局部免疫作用。,免疫调节 参与机体的正、负免疫调节作用。,各类免疫球蛋白的特性和作用,IgG,出生后3个月开始合成，3-5岁接近成人

15、 分布于血液和体液中 血清中含量最高75-80% 抗感染的主要抗体 可发挥调理作用、激活补体、ADCC作用等 唯一可通过胎盘的抗体,IgM,分子量最大的抗体,只分布于血液中 个体发育过程中最早合成和分泌的抗体。 感染早期合成分泌的抗体。 天然的血型抗体 激活补体的能力强于IgG B细胞表面的主要成分，与B细胞的分化程度相关,IgA,分sIgA与IgA两型 参与局部免疫应答,IgE,血清中含量最少的抗体 可引起型超敏反应,IgD,半衰期最短的抗体 与B细胞的分化成熟程度相关,抗体工程,抗体研究进展3个阶段： 1890年白喉抗毒素，多克隆抗体； 1975年杂交瘤技术单克隆抗体； 1994年基因工程

16、抗体；,单克隆抗体（mAb）,定义：通过B细胞杂交瘤技术, 获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体. 特点：纯度高，特异性强，效价高，少或无交叉反应 应用：诊断、治疗,杂交瘤技术的原理,1.亲本细胞的选择 a.小鼠骨髓瘤细胞 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶 (HGPRT) 缺陷型 b.免疫脾细胞 经抗原免疫的BALB/c小鼠的脾脏,2. 细胞融合,骨髓瘤细胞 PEG 杂交瘤细胞 脾细胞 融合后细胞的类型: 未融合的脾细胞 杂交瘤细胞 未融合的瘤细胞,3 杂交瘤细胞的选择性培养,3 杂交瘤细胞的选择性培养 DNA合成的途径： 糖+氨基酸 氨基喋呤 (Aminopterin,A)

17、 TK 核苷酸 DNA 胸腺嘧啶核苷 TMP (Thymidine,T) 核苷酸前体 次黄嘌呤 HGPRT IMP (Hypoxanthine, H),融合后细胞在HAT培养基中存活情况 脾细胞（ HGPRT+, TK+, 不能长期生长） 骨髓瘤细胞（ HGPRT-, TK-，不能生长 ） 杂交瘤细胞（ HGPRT+, TK+ ，能够生长）,4. 杂交瘤细胞的筛选和克隆化,筛选： 免疫荧光 ELISA等 克隆化： 有限稀释法 单个细胞显微操作法 软琼脂培养法,5. 单克隆抗体的生产 体内：BALB/c小鼠体内诱发含有单抗的腹水 体外：无血清培养基悬浮培养等 6. 单克隆抗体的纯化 硫酸铵沉淀法

18、 离子交换层析 A蛋白-Sepharose亲和层析,单克隆抗体在医学上的应用,（一）用作诊断试剂 1. 检测淋巴细胞表面分子，区分不同分化 阶段的淋巴细胞，鉴别淋巴细胞。 2. 鉴定病原体，准确诊断传染病。 3. 用于肿瘤的诊断和分型 4. 激素类单抗用于测定体内激素含量，判 断内分泌的功能状态,（二）用作研究工具 纯化蛋白质（亲和层析） 分析和探查抗原结构 分析抗原决定簇分子的功能 （三）用于疾病的治疗 抗细胞表面分子单抗，用于移植排斥反应的防治 抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治疗 抗肿瘤单抗用于肿瘤的定位诊断和导向治疗,单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题 单克隆抗体的特异性 由于肿瘤特异

19、性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应 异种抗体反应 鼠源性单抗用于人体，导致异源性超敏反应,基因工程抗体,又称重组抗体它是在充分认识Ig基因结构与功能的基础上，应用DNA重组和蛋白质工程技术，按人们的意愿在基因水平上对Ig分子进行切割、拼接或修饰，重新组装成的新型抗体分子。基因工程抗体保留了天然抗体的特异性和主要生物学活性，去除或减少了无关结构，并可赋予抗体分子以新的生物学活性，因此比天然抗体具有更广泛的应用前景。,改造鼠源性抗体 人源抗体（噬菌体抗体） 抗体改造（双特异性抗体）,改造鼠源性抗体,人鼠嵌合抗体（chimeric） 改型抗体（reshaping Ab）或

20、人源化抗体（humanized Ab） 小分子抗体（minimolecular Ab）,人鼠嵌合抗体（chimeric）,定义：从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。 特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。,人鼠嵌合抗体（chimeric）,改型抗体（reshaping RAb）或人源化抗体（humanized Ab）,RAb亦叫“重构型抗体” CDR移植抗体（CDR grafted antibody） 替代通过人体免疫难以诱生的特异性的抗人抗原抗体,小分子抗体（minimolecul

21、ar Ab）,优点： 免疫原性较低 易通过血管壁，可有效克服肿瘤对抗体治疗产生的生理阻抗 无Fc段，不会与非靶细胞的FcR结合，易渗透至病灶局部，故用于体内肿瘤定位成像时，本底低，图像清晰，并有利于作为导向药物的载体。,局限性： 与靶细胞表面抗原的结合力较弱，半衰期较短，很快从血液中被清除，从而影响到达肿瘤部位的抗体浓度。,Fab片段：,Fab片段由重链VH加CH1及完整的轻链构成，大小为完整抗体的1/3。 Fab穿透实体瘤的能力强，且在体内有较高的肿瘤灶/血液浓度比。,单链抗体(single chain Fv，ScFv)：,单链抗体分子是由一条单一肽链按VHLinkerVL或VLlinker

22、VH的顺序组成。其大小仅为完整抗体分子的16，是抗体与抗原结合的最小单位。 ScFv较之Fab的优点是分子更小，更有利于穿透组织和清除，ScFv基因片段还可以与适当的酶基因或毒素蛋白基因重组，用于产生酶联抗体或重组免疫毒素。单链抗体的亲和力比相应的Fab低。,Fv片段及其共价联结的衍生物：,Fv片段由VH和VL组成，是抗体的抗原结合部位，分子量只有完整分子的16,单域抗体(single domain antibody)最小识别单位(minimal recognition unit, MRU),单域抗体为VH或VL，分子大小仅为完整抗体的1/12。 由单个CDR构成的小分子抗体称最小识别单位，具有与抗原结合的能力，但亲和力极低，使其实际应用受到限制。,噬菌体抗体(phage antibody),是将克隆的人Ab V区基因与一种丝状噬菌体DNA上的基因III或基因VIII精确连接，转染细菌后在其膜表面表达Fab段(或单链抗体)噬菌体外壳蛋白(基因III或VIII产物)的融合蛋白。,双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb),又称双功能抗体(bifunction antibody，BfAb)，即一个抗体分子中的两个抗原结合部位可分别结合两种不同的抗原表位。 临床治疗中，已尝试应用BsAb进行