《基因芯片技术》第10章-基因芯片与医学.ppt

1、基因芯片技术,Gene chip technology,内容提要： 了解肿瘤基因组学 了解基因芯片在肿瘤基因组学的应用 了解药物基因组学 了解基因芯片在药物基因组学的应用 了解分子诊断的概念、方法 了解基因芯片用于单核苷酸多态性检测,第10章 基因芯片与医学,肿瘤的研究美国1971年颁布国家癌症条例开始抗癌大战,“ is an abnormal mass of tissue, the growth of which exceeds and is uncoordinated with that of the normal tissues, and persists in the same exc

2、essive manner after cessation of the stimuli which evoked the change”,Willis, 1952,肿瘤是一团不正常的组织，在正常组织中快速、不协调的生长，并且在刺激其产生这种变化的因素消失以后，这种不正常的生长仍然持续。,Basic Biologic Features of Neoplasms肿瘤基本的生物特征,分化Differentiation,不正常增殖Abnormal Proliferation,血管再生 Angiogenesis,转移，入侵性 Invasion,衰老Senescence,细胞凋亡Apoptosis,恶性

3、肿瘤Oncogenic Lesion (e.g. RAS, MYC, E2F Activation),正常细胞经过多步才能变成变肿瘤Neoplasms Evolve in Multiple Steps,Initiation: presumably occurs through irreversible or stable damage to DNA Promotion: an process bringing about a clonal expansion of initiated cells Progression: results when genetic instability lea

4、ds to further mutagenic and epigenetic changes,发生：推测可能是由不可改变的或者稳定的DNA损伤开始的 。 促进：一个程序导致DNA损伤细胞开始无性克隆 继续：当遗传上的不稳定导致更多的肿瘤诱导物产生，无性克隆细胞就变成肿瘤细胞,肿瘤的发生（Initiation）,Tumor initiation：Cooperative DNA lesions as common final pathway Precancerous and incipient（初始的） lesions Molecular targets：Oncogenes, tumor supp

5、ressor genes green, down-regulated miRNA; black, no difference).,PCR Arrays are the most reliable tools for analyzing the expression of a focused panel of genes. Each 96-well or 384-well plate includes SYBR Green-optimized primer assays for a thoroughly researched panel of relevant, pathway- or dise

6、ase-focused genes. PCR Arrays can also be customized to contain a panel of genes tailored to your specific research interests.,比较基因组杂交芯片CGH array,杂合性缺失（loss of heterozygosity）,杂合性指同源染色体中不同等位基因存在于一个或多个基因位点中的现象；野生型拷贝或等位基因发生缺失就称为杂合性缺失（LOH），LOH通常是由染色体缺失或重组引起。绝大多数人类肿瘤都存在非随机性的染色体片段丢失。杂合性缺失在肿瘤细胞中是一种非常常见的DN

7、A变异。 肿瘤中存在基因的扩增 通过比较肿瘤组织与体细胞组织中野生型和突变DNA的比值可以检测LOH以及基因的扩增,比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH ）,一种分子细胞遗传学技术，能够通过一个简单的杂交反应检测出整个基因组DNA拷贝数改变。主要原理是采用经过荧光标记的肿瘤基因组DNA和正常基因组DNA为探针，与正常人中期染色体标本进行原位杂交，根据两种探针荧光信号的强度差异找出基因组中DNA的增加或缺失区域。,aCGH (Array Comparative Genomic Hybridization),比较基因组杂交（简称CGH）的方法被

8、用来监测染色体基因组的改变。CGH最突出的优点在于：通过一次实验就能完成对整个基因组中所有遗传物质增加或丢失的分析，实验所使用的DNA可以是从新鲜冻存的组织中提取的，也可以提取自福尔马林固定石蜡包埋的保存材料。,aCGH (Array Comparative Genomic Hybridization),CGH主要用于肿瘤细胞染色体DNA片段的缺失和增加的检测，同时对其它与染色体拷贝数变化有关的疾病也能进行分析和检测，如小儿自闭症，先天性发育迟缓等一系列遗传病症。 Array CGH就是一种新的用于检测肿瘤细胞染色体拷贝数变化的技术，该项技术能够通过一个简单的杂交反应检测出整个基因组DNA拷贝

9、数改变。主要原理是采用经过不同颜色荧光标记的肿瘤基因组DNA和正常基因组DNA与芯片上结合的覆盖全部人类基因组的寡核苷酸探针杂交，根据杂交后两种探针荧光信号的强度差异找出基因组中DNA的增加或缺失区域。,aCGH的特点: 高通量（覆盖人类全基因组的探针设计，包括针对基因外显子、内含子和基因间序列的探针，一张芯片上探针的数量接近24万个探针），高分辨率（24万个探针的平均分辩率在6.4KB,对目前较为了解的基因来说，可以检测到这些具体的基因的单个拷贝数的变化Agilent，Nimblegen分辨率为6KB）。,利用基因芯片并行检测前列腺癌染色体畸变和基因表达谱,研究所用48例前列腺癌样本和10例

10、正常样本（9例前列腺组织和1例肾脏组织）由北京大学附属第一医院提供,11例前列腺癌样本同时进行了表达谱和CGH实验。,芯片类型：博星基因芯片有限公司的8000点的基因芯片（cDNA芯片）,整合分析 11例前列腺癌样本同时进行了表达谱和CGH实验。我们对这11个样本的每个样本计算了余弦相关系数以考察CGH和表达谱的一致性。 为了寻找表达受到染色体畸变影响的基因，挑选处于染色体扩增区（在 10% 的18例前列腺癌）的表达上调（在25例前列腺癌）的基因和处于染色体缺失区（在 10% 的18例前列腺癌）的表达下调（在25例前列腺癌）的基因。 对每个挑选出来的基因计算了Jackknife相关系数来评估其

11、表达水平和DNA拷贝数的关系。,53个基因表达可能受到染色体畸变影响,本研究发现的常见染色体畸变区域大部分在以前的研究中报道过，但是与前人的研究结果相比也存在畸变区域和畸变频率方面的一些差异。究其原因，可能有如下几个方面：运用不同的实验手段、不同的分析算法和不同的判断标准都有可能造成研究报道之间的差异；前列腺癌存在种族差异。 发现新的染色体畸变，如Xq21.33-q22.2。,染色体畸变是一个很重要的癌变机制，可能导致位于其上的原癌基因激活或者抑癌基因丢失。 我们的研究发现基因表达水平和染色体拷贝数呈弱的正相关。余弦相关是线性相关，考虑到DNA，mRNA和蛋白质之间复杂的相互作用，我们不能够期

12、待CGH和表达谱呈现一种强的正相关。 我们推测染色体拷贝数变化不是影响基因表达水平的主导因素。很多其它的机制如DNA突变、表观遗传学变化、RNA干扰等都在调控基因表达上起着重要作用。,基因芯片技术,Gene chip technology,Yang Liu（刘洋） College of Life Sciences, Guizhou University E-mail: liuyangbun163. com QQ：652493683 Telephone内容提要：,第11章 SNP分型芯片与药物基因组学,分子遗传标记的特点,直接以DNA形式表现，在基因组中的定位明确，是生

13、殖细胞中存在的变异 (germ cells，egg or sperm) ，可遗传，在生物体各发育阶段，各组织中均可检测到，检测简单易行。,分子遗传标记发展,RFLP restrict fragment length polymorphism 限制性片段长度多态性 SSLP simple sequence length polymorphism 简单序列长度多态性 SNP single nucleotide polymorphism 单核苷酸多态性,SSLP类型,包括:小卫星序列 minisatellite 微卫星序列 microsatellite 小卫星DNA标记：核心序列11-60bp，主要

14、存在于染色体靠近端粒处，由于其拷贝数变化，在不同个体间中存在串联数目的差异，若在重复序列两侧有限制性内切酶酶切位点，则切下来的片段会呈现出多态性。可用于DNA指纹。 微卫星DNA标记：指以2-7个碱基为核心单位串联重复而成的一类序列，由于核心序列重复数目的变化而在群体中呈现出遗传多态性，但在同一家系内具有高度的遗传保守性，以孟德尔方式遗传。散布于整个基因组中。,单核苷酸多态性 single nucleotide polymorphisms,“单核苷酸多态性”（single-nucleotide polymorphisms, SNPs）：一种常见切细微的DNA变异，由单个核苷酸的变异所引起的DN

15、A序列多态性，其方式包括转换、颠换、缺失和插入。,从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2 :1。SNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T，原因是CG中的C 常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。 人类基因序列的变异大多是单核苷酸的变异。不同人群中SNP的频率分布有差异，而这些差异可以代表某一人群的遗传差异。因此，探测SNP的工作可以看作是对人类“遗传路标”（genetic signposts）的勘定。,大多数SNPs是单纯多态性pure polymorphic ，但也有一些与疾病的发生有关联causative

16、 mutations 一般而言， SNP是指在基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同碱基，其中最少一种在群体中的频率不小于1 在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP，人类基因组上的SNP 总量大概是3 106 个。,SNP TGGGTG TGTGTG Coding SNP TGG Thr TGT Thr Mis-sense SNP GTG His GTT Gln,SNP的类型,Intronic SNP iSNP does not cause an amino acid change Regulatory region SNP effect amount of protein expr

17、essed or if expressed. Coding region：Also cover synonymous（同义的） and non-synonymous,SNP分析的特点,SNP数量大，分部密集 SNP比STR扩增更有效 由于SNP是二态的，易于自动化批量检测，易于用计算机分析结果,单基因病：由“单”基因的突变所致的疾病，单基因病不多见且传递符合孟德尔规律，但由于其遗传性，危害很大，如血友病、镰状细胞贫血症、囊性纤维化、亨廷顿舞蹈病等。 多基因病：是由两对以上基因变异所致，且环境因素在这类疾病的发生中起不同的程度作用，如若干人类常见病：肿瘤，高血压、动脉粥样硬化、糖尿病、哮喘、自身

18、免疫性疾病、老年痴呆、癫痫、精神分裂症、忧郁症、类风湿关节炎、智能发育障碍等，其发生受多个微效基因及环境因素影响，存在基因与基因、基因与环境之间的相互作用。,“基因病”,Disease-associated SNPs,ApoE in Alzheimers MTHFR in Cardiovascular Disease心脑血管疾病 p53 in HPV Infection人乳头状病毒传染 Various p450s in Drug Metabolism药物代谢 BRCA1 in Breast Cancer乳癌 HLA in Autoimmune Disease自身免疫系统疾病,Coronary

19、heart disease,Plane crash,基因,环境,Infection,Radiation injury,Bipolar disorder,Cancer,Huntingtons disease,少数单基因疾病,大多数疾病是多基因疾病多种基因和环境共同作用的,疾病发生的复杂机制,SNP在疾病研究中的意义,要在复杂疾病中判断遗传变异产生的效应，就必须对照大量病人与普通人群之间在DNA变异方面的频度差别。首先需要勘定普通人群的遗传变异模式，而SNP的筛选及检测是一个重要方法。 SNP是继人类基因组计划之后又一国际研究竞争新热点，是阐明基因组功能及特点的重要基础。 SNP是人类基因组DNA

20、序列变异的主要形式，是决定人类疾病的重要遗传基础。,Linkage study Tries to see if two genetic factors tend to be inherited together in families Tracks the inheritance of the genetic marker alleles (genotypes) through a pedigree of a family or set of families, that exhibit a specific disease (phenotype) The closer the marker

21、is to the disease gene, the less frequent crossover events will occur between the alleles of the marker and the disease gene A linkage study over the entire genome is called genome scan.,Association study Population-based instead of family-based Case-control study: Case: a group of people affected C

22、ontrol: a group of people not affected Important to match age, sex, ethnic group, and other environmental factors Choose candidate gene marker and genotype both groups If a particular allele (genotype) is much more abundant in the cases compared to controls, that allele is implicated in the disease,

23、Prospective study（调查研究） cohort study,a longitudinal study in which a population of subjects,initially free of disease ,are followed for a defined period and new disease recurrence recorded. Retrospective study（回顾性研究） case-control study,drawbacks of cohort study is that when Incidence is low ,large a

24、nd lengthy studies must be required to give adequate statistical power,case-control study is an Alternative way which avoid this difficult,Study design,属于回顾性研究，是观察性研究中常用的一种设计方案 样本：患有某病的病例组和不患有该病的对照组 具有某项特征的病例和不具有某项特征的病例 方法： （1）调查某段时间内是否有暴露于某因素的历史，而该因素被疑为和该病的发生有联系，或者调查是否存在某因素，而该因素疑为和疾病的某项特征有联系。 （2）比较

25、两组情况，验证某因素和疾病是否确实存在联系，联系的性质和程度。 病例与对照研究可用于研究：疾病致病因素、疾病危险因素、药物有害作用、影响疾病预后的因素等。,病例与对照研究,队列对照研究可采用前瞻性方式，以开始观察的时间为始点，将被观察的人群按其是否接触可能的致病因素，分为两个群体，随访一定时期后，确定并比较各群体中新发生病例数或某种效应的差异。 队列对照研究是群体研究中常用的方案，被观察的人群是否接触某种致病因素，是自然分配而形成的两个群体，研究者既不能随机安排，也不可能加以控制。,队列对照研究,研究对象要有足够的观察时间，在自然病程中要有充分的时间，使危险因素的作用能够表现出来。全部被观察者

26、都必须进行随访，队列中失访人数增加，将会影响所观察的结果。 凡在群体中研究可能的致病因素或某项处理措施对固定人群的影响，均可使用队列研究，常用于病因研究，治疗性研究，预防性研究或预后研究。,队列对照研究,Disease Diagnosis（疾病诊断）,Each person has a unique SNP profile Most SNPs are not responsible for a disease state. Instead, they serve as biological markers for pinpointing a disease on the human genom

27、e map, because they are usually located near a gene found to be associated with a certain disease. Occasionally, a SNP may actually cause a disease and, therefore, can be used to search for and isolate the disease-causing gene.,Variation at chromosomal level（染色体水平的变化）,染色体多态性包括 DNA片断的倒位，插入，缺失 染色体的特异位

28、点存在拷贝数的变异copy number variations/ polymorphisms (CNV/ CNP)。 Gene copy number Segment copy number,2006年11月Nature,科学家对来自中国、日本、美国、尼日利亚等国270位身体健康者的DNA进行比较，绘制出CNV图谱。他们识别了1447种不同的CNV，占到人类基因组比例的12%左右。其中约285种与诸如精神分裂症、牛皮癣、冠心病和先天性白内障等疾病有关。 一个人的DNA代码同另一个人的DNA代码约有1的不同之处。 CNV不同会影响到基因的活动能力和抗疾病能力。科学家发现，人类已知的致病基因中，1

29、6存在CNV。,利用寡核苷酸基因芯片检测SNP/突变,基因组DNA的标记,基因芯片无论用于何种DNA检测，首先需要从样本中制备DNA，样本基因组制备和标记是基因芯片实验中的关键实验步骤。 表达谱基因芯片由于mRNA的polyA尾的特征很容易实现同时检测样本的整个转录组，但在基因组DNA的标记检测中，人们必须面对两个难题：一是灵敏度问题，二是全基因组的标记问题。 不同的样本有着不同的制备方法。对人和其他大部分原核和真核生物基因组结构与组成的分析必须直接针对基因组DNA进行，而很多病毒属于RNA病毒，例如HIV、HCV和SARS病毒等。它们的抽提难度相对较大，而且在大多数情况下需要先把抽提的RNA

30、逆转录为DNA。,非扩增标记法,直接对基因组DNA进行酶促反应标记法，如随机引物标记（例如，Klenow DNA聚合酶法）等。 基本能实现全基因组标记，但灵敏度有一定限制，在样本量足够的情况下，可用于基因拷贝数的检测,特异性引物PCR扩增标记法,为了提高检测灵敏度，大部分样本靶序列需要经过高效而特异的扩增。特异性引物PCR/多重PCR是采用最多的扩增方式。PCR扩增的同时可以进行染料标记，可以是带染料标记的dNTP单体掺入标记，也可以是引物5端带上特定的染料。 PCR本身存在的缺陷：多重PCR的不稳定性；多重PCR无法做到全基因组扩增；PCR是指数扩增，不能用于检测DNA拷贝数的检测。,多重P

31、CR,在芯片的应用中，为了简化操作，降低成本，满足基因芯片高通量的特点，往往需要进行多重PCR（multiplex PCR）。 所谓多重PCR，就是一个PCR反应中，多对引物同时扩增相应的模板。多重PCR的实际操作中会遇到许多困难，主要包括较低的特异性和灵敏度，各靶分子扩增的效率差异大，即有些靶序列扩增效果好，有些差或扩增不出，以及因为模板等因素的变化而导致扩增的稳定性差。,提高检测灵敏度的方法,引物PCR产物是双链DNA，而杂交时却只需要其中的一条，另外一条链严重影响杂交的效率 合成目标PCR链的引物5末端的加上保护接头，防止目标链被核酸外切酶的消化，而将另一条不需要的单链DNA用核酸外切酶

32、消化 采用不对称PCR，增加PCR产物中的目标链,基于PCR方法的全基因组扩增法,primer extension preamplification (PEP) ，该方法首先用限制性酶消化基因组DNA，消化片断加上接头，最后用和接头匹配的引物扩增 degenerate oligonucleotide primed PCR (DOP-PCR) ，该法应用一组随机引物非特异性地扩增基因组DNA，有极高的扩增效率，检测灵敏度达到pg级的DNA样本，而且扩增无偏倚，和比较基因组（comparative genomic hybridization, CGH）方法联用，可用于微量样本的基因拷贝数的分析,E

33、xperiment process of SNP mapping array,基于芯片的SNP检测,通过酶反应的间接杂交 直接杂交,直接杂交法检测SNP或突变,直接杂交方法中，靶序列（荧光PCR产物）根据他们与芯片上探针结合程度的不同区分，杂交条件需要严格控制。细微的序列差异（PM,MM，突变/差异碱基设计在OLIGO正中间）导致了不同的探针-靶序列反应和不同的杂交动力学，从而引起了不同的信号强度，要求十分严谨的杂交条件，有些时候杂交探针非特异性信号较强 对于每一位置的野生型探针，在其中央位置的某一碱基分别用A,G,C,T四种碱基替换，形成4种中央位点不同的核苷酸探针，将得到的4个探针依次固定

34、在芯片上。 筛选SNP以及对已知SNP进行分型,三种不同基于芯片检测SNP方法的原理图示。A.直接杂交法;B.引物延伸法;C连接酶检测法. 红线代表荧光标记的靶基因或报告探针。黑线代表未标记的靶基因。黑色箭头表示未标记的SNP位点，而红色箭头代表标记的SNP位点或标记并整合的ddNTP,Mapping Arrray Probe Design,Affy公司的探针设计方法,酶反应方法检测SNP/突变,酶反应鉴别模式下，杂交条件相对不需要非常严格，因为检测灵敏度通过聚合酶或连接酶反应提高，信号来自于荧光寡核苷酸探针或标记的ddNTPs，而不是靶序列。 基于酶学方法的基因多态性检测允许探针的3端设计突

35、变碱基。一旦探针的3端和靶基因序列互补，连接酶和多聚酶能够引导序列的延伸，这种特性可以用来区分不同靶基因的序列。这种方法被称为酶催化的延伸法，包括引物延伸法和连接酶检测反应，经常被用于单核苷酸多态性的检测。,三种不同基于芯片检测SNP方法的原理图示。A.直接杂交法;B.引物延伸法;C连接酶检测法. 红线代表荧光标记的靶基因或报告探针。黑线代表未标记的靶基因。黑色箭头表示未标记的SNP位点，而红色箭头代表标记的SNP位点或标记并整合的ddNTP,引物延伸法,检测用的引物即探针被共价固定在玻片上，这种方法结合了寡核苷酸芯片的高通量和DNA聚合酶的特异性，典型的芯片引物延伸法的原理与Sanger的双

36、脱氧核苷酸测序法的原理相似，也称为微测序法（mini-sequencing）。 利用DNA聚合酶整合四种标记不同荧光的ddNTPs，酶学延伸将会根据寡核苷酸引物3末端的特定序列延伸特定的ddNTPs，即只延伸一个碱基，且与靶分子互补。有高的特异性，同时也很敏感。,三种不同基于芯片检测SNP方法的原理图示。A.直接杂交法;B.引物延伸法;C连接酶检测法. 红线代表荧光标记的靶基因或报告探针。黑线代表未标记的靶基因。黑色箭头表示未标记的SNP位点，而红色箭头代表标记的SNP位点或标记并整合的ddNTP,连接酶法,连接酶反应 (LDR, Ligase detection reaction)分析单核苷

37、酸多态性的芯片方法，基于连接酶能够区分匹配和非匹配探针末端与标记的报告探针的连接反应。探针和报告探针之间的连接反应由靶基因引导。 DNA连接酶是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键，但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的（T4连接酶除外），而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键 等位基因的SNP位点分别设计在引物（探针）的3端，两个探针的唯一区别就是3末端的碱基，分别对应不同靶基因的序列，DNA连接酶和荧光报告探针在探针和未标记靶基因的芯片杂交过程中或杂交后加入。 采用嗜热的DNA连接酶

38、，它结合了区分单碱基变化的高度特异性，同时能在大的温度范围内保持活力。,三种不同基于芯片检测SNP方法的原理图示。A.直接杂交法;B.引物延伸法;C连接酶检测法. 红线代表荧光标记的靶基因或报告探针。黑线代表未标记的靶基因。黑色箭头表示未标记的SNP位点，而红色箭头代表标记的SNP位点或标记并整合的ddNTP,SNP分型芯片,Beckman SNPstream,GenomeLabTM SNPstream Genotyping System Up to 12 plex & 48plex,12 plex 一共16个点 48 plex一共52个点,SNPstream Process Overview

39、,Primer design Simple 3-step assay Signal detection Automated Data analysis,PCR & Cleanup,PCR: AmpliTaq Gold ABI Cleanup （纯化）: ExoSAPIT USB,Primer extension,Primer Extension,A,C,Hybridization & Detection,专利的单碱基延伸与标签微阵列（Tag-array）相结合，分型准确率超过99% 单碱基引物延伸-微测序法（mini-sequencing） 微阵列 在一种新型的玻璃板底的384孔板上人工合成寡

40、核苷酸微阵列，与SNP单碱基延伸引物的“标签”互补,技术路线,单碱基延伸 标签阵列,3,5,PCR 产物,SNP 位点,末端标记的 ddNTP,5,3,需要的引物,一对PCR引物 18-25 nt 一条带有标签的SNP引物 (40-45 nt) 3 SNP 区域 (20-25 nt) 5 标签阵列尾巴 (20 nt) 无需复杂的修饰或者特别的纯化,基于网络的引物设计工具 快速、可靠、便于使用 输入含SNP位点的多条序列，最多可一次输入1000条 将这些序列按12个或48个SNP位点分组 为每个SNP位点设计一对PCR引物（20bp）和一条单碱基延伸引物 (45 bp) 为单碱基延伸引物分配相应

41、的标签（Tag） 生成输出文件,SNPware 标签阵列,384孔的规格 每个孔包含16个或者52个“点” 包括12个或48个标签，4个对照 每一个“点”是一个已知序列的寡核苷酸链(标签) 板上的每一个标签与12个（或48个）延伸引物的其中一个标签互补 阵列板的大小/形状与处理标准多孔板自动化系统兼容 每一板上SNP的panel数量可根据研究需要灵活设置,成像步骤,Imaging Channel 1 (等位基因 X-这里是G),GC,CC,GG,CC,CC,CC,CC,GC,GC,GC,GG,GG,GG,GG,激发双色荧光，CCD成像,Imaging Channel 2 (等位基因Y-这里是C

42、),SNPstream 系统特点,检测精确度高，信息高度保真 灵敏度高，DNA用量很少 实验成本低 通量灵活，可扩展性大 完整的解决方案 操作简单,Nature Volume 427, Feb 2004,Leprosy: 麻风病,Diabetes Volume 53, Dec 2004,Diabetes Volume 53, Dec 2004,A,G,illumiCode Address,Allele Specific Extension & Ligation,Universal PCR Sequence 1 Universal PCR Sequence 2,Universal PCR Seq

43、uence 3,GoldenGate 检测等位基因特异性延伸和连接,Genomic DNA,T/C,Ligase,T/A,Polymerase,特定SNP位点检测,引物设计,Genomic DNA template,SNP,(1-20 nt gap),the ASOs each have a different 3 base specific for the two possible alleles of the SNP,Allele Specific Extension,Address,P3,P1,P1,P2,P3,PCR with common primers,P1,Address,Pro

44、duct capture by hybridization to array,通用的芯片设计,/,/,/,Address 1,2,3,Target 1,Target 3,Target 2,/,/,/,illumiCode #561,illumiCode #217,illumiCode #1024,GoldenGate 检测和独特的带 IllumiCodeTM 编码序列的芯片杂交,/,/,A/A,G/G,C/T,SNP #561,SNP #217,SNP #1024,总结,通过等位基因特异性延伸进行精确地SNP定位 高准确度和CALL RATE（0.99) 仅需全基因组 DNA而无需扩增 仅需2

45、50ng 全基因组DNA 即可完成1536 位点的研究 可接受质量较差的样品如全基因组中扩增出的DNA,特定SNP位点检测,小 结,基于基因芯片的SNP检测方法：直接杂交法，酶促反应法 SNPstream检测方法 GoldenGate 检测,药物基因组学,相关的组学研究,基因组多样性在一定程度上决定了人体对药物的反应，通过对影响药物代谢，或效应通路有关基因的编码序列的再测序，有可能提示个体对药物反应差异的遗传学基础，也是面对基因型特异性治疗取得成功的基础 药物基因组学（Pharmacogenomics）的定义大体上接近药物遗传学（Pharmacogenetics） ，一些高通量的技术被用来测定

46、药物应答的基因型标志：药物效应的基因型预测，在分子水平证明和阐述药物疗效，药物作用的靶位、作用模式和毒副作用。药物基因组学是分析基因组及其产物（转录组和蛋白质组）与药物反应的相关性学科。 环境基因组学以此作为延伸，提示个体对环境反应差异的遗传学基础。,DNA芯片技术与药物基因组学,应用DNA芯片，可以加速药物基因组学的发展，主要是利用DNA芯片进行基因功能及其多态性的研究，以确认与药物效应及药物吸收、代谢、毒副作用等相关的基因 SNP作为基因组的标志之一，与疾病和药效的变化相关联。在药物基因组学研究中，大规模地确定治疗意义上的SNP多态性是研究重点之一。 DNA芯片利用药物基因组学的研究成果，

47、按照药物类型根据基因型将人分群，指导个性化治疗,药物代谢,药物相互作用一般分为药动学相互作用和药效学相互作用。药动学相互作用可发生在吸收、分布、代谢、排泄4个阶段，其中代谢性相互作用发生率最高，约占药动学相互作用的40，具有非常重要的临床意义。 药物代谢的主要场所是肝脏，肝脏进行生物转化则依赖于多种酶系，其中最重要的是细胞色素p450（简称cyp450），而在cyp450中最重要的是cyp3a4亚族，参与约占该酶系中全部药物代谢的50%，cyp2d6约占30%，cyp2c9约占10%，cyp1a2约占4，cyp2a6和cyp2c19分别约占2，它们参与人体中约300余种药物的代谢。,Drug

48、Metabolism,Liver,Kidney,Drug (small molecule),Metabolism Enzymes,药物效应基因drug-response gene,药物效应基因所编码的酶、受体、离子通道及基因本身作为药物作用的靶，是药物基因组学的研究关键所在，是确定病人如何产生药物疗效、疾病亚型分类的依据、毒副作用的基础。 这些基因大致上可分为三大类。第一类，编码一系列肝脏酶，它们与药物的代谢有关，被称为细胞色素p或CYP酶；第二类，药物效应基因是和疾病本身联系的，很明显这一组遗传成分引起了疾病，而这些疾病的分类似乎逐步增加。第三类，药物效应基因是基因的表达产物蛋白质，它们既不

49、和疾病本身也不和药物代谢相关，而是在病人服用药物的过程中引起副作用。,Variation in Drug Response,Absorption Distribution Metabolism Excretion Target Interaction,Systematic Approach: DNA, RNA & Proteins,基因型影响药动学已有P450等位基因的差异对于药物代谢的影响得到证实。 人们已通过严格定义的多态性来鉴定等位基因编码的酶，如P4502D6和P4502Cl9，业已建立的表型试验已用于测定这些多态性，基因型实验已能够预测在个体中这些酶何时处于药物代谢的低水平状态。 应

50、用不同的P450基因型评价新药在临床试验中的疗效，这代表着以P450基因型为基础的个体化治疗的第一步。,cyp450可受遗传、年龄、机体状态、营养、疾病、吸烟、饮酒等各种因素的影响，尤其是药物，能够显著影响该酶的活性。 诱导药酶活性增强（称酶促作用），使其他药物（称底物）或本身代谢加速，导致药效减弱（但可使前体药物更快发生药效）的药物，称为药酶诱导剂。抑制或减弱药酶活性（称酶抑作用），减慢其他药物（底物）代谢，导致药效增强的药物，称为药酶抑制剂。 为减轻或避免代谢性药物相互作用的发生，最简便易行的方法是合理选用药物，而考虑cyp450酶至关重要。,AmpliChip CYP450 Test,T

51、he test detects genetic variations in the Cytochrome P450 2D6 and 2C19 genes and provides the associated predictive phenotype (poor, intermediate, extensive, or ultra-rapid metabolizer). 中南大学 天津生物芯片技术有限责任公司,细胞色素氧化酶P450 2D6,细胞色素P450 2D6（Cytochrome P450 2D6，CYP2D6）是细胞色素药物代谢酶中较为重要的一种，由497个氨基酸组成。主要参与多种重

52、要药物的代谢，包括多种抗心律失常药、1受体阻滞药、抗高血压及三环类抗抑郁药等。CYP2D6参与代谢的药物占总P450代谢药物的30%。 CYP2D6的基因多态性会导致患者代谢药物能力的很大差别。当患者的基因型是CYP2D6*1/*1时，属于强代谢型（EM）；当患者的基因型是CYP2D6*1/*10时，属于中等代谢型（IM）；当患者的基因型是CYP2D6*10/*10时，属于弱代谢型（PM）。同样是美托洛尔用药的常规剂量为25mg/次，2次/d，对于EM者，推荐剂量为常规剂量的140%；对于IM者，推荐剂量为常规剂量的60%；对于PM者，推荐剂量为常规剂量的30%。目前，人们已经能够常规地应用不

53、同的P450基因型来评价新药在临床试验中的疗效。,高血压类药物个体化用药检测芯片,临床上用于高血压治疗的药物主要有6类：血管紧张素转换酶抑制剂、阻滞剂、阻滞剂、利尿剂、血管扩张剂、钙通道阻滞剂。 将与药物作用相关的基因进行综合分析，才能给出比较合理化的给药方案。 研究较多的与高血压药物相关的基因包括：CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2D6*10、CYP2D6*5。At1R、ACE、389、49。将这些基因的相应位点制成芯片。 检测这些位点的基因型，经过分析，就能给出患者究竟适合服用哪种高血压药物，而且能够给出推荐服用的剂量。临床医生可根据该检测结果指导病人用药。

54、 检测过程仅需要病人3ml血液，能够在78h内迅速得到病人的基因型检测结果，并配合专用软件，向临床医生提供明确的个体化用药意见。,药物结合位点SNP与药效,由于药物结合位点微妙构造的变化，就药物靶与药物作用的敏感性而言，药物作用的药效学受遗传差异的影响。药物的细胞攫取和排出，甚至药物靶的精确的生理功能也存在着个体差异。 药物结合位点的遗传差异影响药物疗效的一个例子是支气管扩张药沙丁醇胺（salbutamol，舒喘灵）。舒喘灵的作用靶是-2-肾上腺素能受体（beta-2-adrenergic receptor）。人们在研究了269位哮喘儿童后发现，-2-肾上腺素能受体上第16位氨基酸甘氨酸或精氨

55、酸的变化与舒喘灵疗效的差异相关。舒喘灵对精氨酸纯合子（homozygous，在一定位点上具有一对相同等位基因）个体比对甘氨酸纯合子个体的作用强5倍。舒喘灵对哮喘的治疗作用依赖于药物靶和基因型的精细结构。,Potential of Pharmacogenetics,All patients with same diagnosis,1,2,Responders and patients,not predisposed to toxicity,Non-responders,and toxic,responders,Treat with alternative,drug or dose,Treat w

56、ith,conventional,drug or dose,个性化治疗,绝大多数处方药只对不到一半的患者有效，而且药物的副作用比疾病本身还要严重。传统医药行业采用的在数以百万计的患者中推而广之的治疗方法正遭受挑战。 传统检测手段无法表明药物对哪些患者是有效的，对哪些病人不宜服用。 开处方之前对病人进行相应的基因扫描，可帮助确认药物毒性最患者的潜在毒性以及最适剂量 “生物芯片技术将带来个性化治疗的新时代，对于疾病诊断来讲，以前有可能是只看到一片树叶或一棵树木，生物芯片则可以使我们看到一片森林，对原有的诊断是个有力的补充和发展。”,个体化用药基因检测芯片,将与药物作用相关的代谢酶、转运蛋白、受体等

57、的基因制成芯片，为适应不同的检测需求，制成相应的检测芯片。 根据基因芯片检测的结果，对患者的相关基因型进行分析。 根据患者基因型调整患者用药的种类或者用药剂量，也可以预知患者可能发生严重不良反应的风险。 这类基因检测芯片在临床上的应用，是实现现行医疗模式转变的有效手段。,基因转录分析是基因型分析的有利补充,理论上讲药物基因组学的研究能够预测药物对疾病治疗的效果，但它仍不是诊断和确定病人实际生理状态的最有力武器，疾病进程，疾病、药物作用和DNA者之间的关系是间接的，但唯有蛋白质分子而非基因才是与疾病进程和药物作用的最终表现形式，基因型在某些情况下尚不能充分说明疾病进程或患者实际生理状态下药物的作

58、用 对相同疾病患者的分类和治疗不仅依据于静态的基因型，更重要的是按照动态的生理状态，生理水平上的临床试验与基因型的关系不显著 应用功能基因组学技术测定mRNA，揭示基因的动态转录是分子生理学分析的一种方法，结合芯片技术对于揭示药物与受体的动态结合，药物疗效的潜在差别十分重要。 mRNA表达分析应用于药物早期临床试验的安全谱分析，测定用药后，靶器官中产生了哪些mRNA，以建立与药物毒性相关的表达模式。,mRNA表达分析最主要的缺点是不能预测药物与蛋白质的作用。因为mRNA和蛋白质的关系在许多情况下，在结构上和动力学上是高度非线性的。从结构上讲，转录RNA的遗传密码并不完全包含翻译后的遗传信息，如糖基化和磷酸化，通常这对蛋白质的功能、疾病的进程和药物作用是至关重要的。从动力学上讲，mRNA和蛋白质在体内具有不同的半衰期，或者在不同的生理条件下，蛋白质的产生过程是不同的，mRNA和蛋白质水平的非线性关系在许多组织的研究中得到证实。mRNA和蛋白质的丰度（ab