酶标仪和多功能酶标仪.ppt

1、，酶标记器的使用，主要内容，1，ELISA方法介绍2，酶标记器和多功能酶标记器3，仪器操作，1，ELISA方法介绍，经典化学分析方法(如滴定分析、重量分析、分光光度法)对化学体系成分进行常数或微量分析在这种背景下，科学家们具有免疫化学法(如酶联免疫法、免疫荧光法、放射免疫法)牙齿高特异性、超微量分析有机成分的特点，因此迅速普及和发展。1971年，人们建立了用酶标记抗原或抗体的分析技术，使原本极微小的抗原或抗体能在几分钟后识别出来，进行定量。牙齿技术称为酶联合免疫吸附试验法，又名ELISA。酶联免疫法(enzyme-linked immuno-sor bent assay)酶联免疫法的专用仪器是

2、酶标仪。分析原理、酶标仪的分析原理与分光光度法一样，服从朗伯维尔定律。物质的含量与发色液的颜色浓度成正比，颜色的浓度可以用吸光度表示，因此物质的含量与吸光度值成正比。酶对抗原或抗体发生免疫学反应后，与基质的结合物在特定波长有最大吸收，可以通过发色液的吸光度测定定量测定物。ELISA法律知识，1 .免疫学知识2。常用ELISA分析3。ELISA应用程序节目，1 .免疫学知识，抗体是什么？什么是抗原？什么是抗原抗体反应？什么是抗体(Antibody)？抗体是机体受到抗原刺激后，能与体液中出现的相应抗原反应的球蛋白，称为免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)。人类免疫球蛋白有五种茄子类别：

3、IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。含有免疫球蛋白的血清称为免疫血清。免疫球蛋白(Ig)、免疫球蛋白(Ig)是机体受到抗原刺激而产生的，主要作用是引起抗原和免疫反应，产生抗原抗体复合物。可以防止病原体对机体的危害，引起过敏反应或其他有害反应。免疫球蛋白的结构，免疫球蛋白都是大分子的物质，轻链，重链，抗原结合的部位。抗原是什么？能刺激机体产生抗体并结合抗体和特异性的物质称为抗原。物质具有的这种特性称为抗原性。抗原的物质可以牙齿为机体本身的成分，如蛋白质、酶、多肽或多糖。也有外来抗原(如病毒、污染物)。抗原的特异性，各种抗原物质的化学构成复杂，但刺激机体生成抗体，与抗体反应相结合的化学构成只是

4、抗原物质表面的活性化学基团、化学结构和空间结构，被称为抗原物质决定簇。分子结构的差异决定了各种物质抗原的特异性。抗原抗体反应，抗原和抗体的反应统称为免疫学反应。体内进行的抗原抗体反应称为免疫反应，体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应。没有抗原刺激，身体就不能产生抗体。可以利用抗体检测抗原物质。ELISA法基于抗原和抗体免疫学反应，具有特异性的特点。测量需要酶标记抗原或抗体，因此酶分子和抗原或抗体分子的结合物能促进基质分子的反应，引起扩增作用，正是由于这种扩增作用，牙齿法变得非常敏感。2 .常用ELISA分析，1)。抗原测定2)。抗体测定，(1)抗原测定，A在固相表面吸附抗体的过程称为包皮。添加

5、b抗原形成抗原-抗体复合物。c加酶标准抗体。d酶反应的气质。反应结束时，反应液的颜色很深，与抗原的含量成正比。主要阶段，1 .涂层抗体酶标(一元)。2.添加要测试的抗原。抗原抗体反应，洗涤。添加酶标记抗体(二项式)。反应，洗涤。4.添加发色气质(三元)、反应、洗涤。5.加终止液。酶标记器读取吸光度值。7.根据标准曲线定量测定抗原。(2)抗体测定，抗原包被放在酶标上。添加b抗体形成抗原抗体复合物。c加酶标准抗体(一元)D加酶底物(二元)，发色，比色。3 .ELISA方法的应用，原则上ELISA可用于检测所有抗原、抗体和抗原，并可直接定量测定体液中的可溶性抗原。在实际应用中，与医学、生物化学、免疫

6、学、微生物学、药理学、环境学等密切相关。例如医学方面：肿瘤研究中的甲胎蛋白检测；检测过敏原。检测血清白蛋白和免疫球蛋白；在传染病诊断中检查乙型肝炎表面抗原。环境科学：在污染物抗原的干预下测定生长因子、细胞因子、酶的变化。其他：在植物组织浆液中检查植物病毒；一般比色分析。2，酶标记器和多功能酶标记器，一般酶标记器多功能酶标记器，1。一般酶标(ELISA Reader)、Bio-Rad模型550，4 550，4万韩元、光源、光电探测器光源：钨灯过滤器：常用波长范围：405nm 450nm(四甲基联苯胺)490nm仅在固定波长的可见光范围内测量。可以对化学物质和生命成分进行终点站分析。酶标记器的应用

7、，一般酶标记器的基本功能有两个。(1)相当于分光光度计：化合物含量测定或细胞存活率测定等。(2)基于免疫反应的ELISA分析。新型多功能酶标记机的价格达20 50万韩元，分析功能广泛扩大，对酶标记机的应用具有深远意义。ELISA的局限性，世界卫生组织专家组提出了对ELISA的评价。“ELISA是免疫诊断应用程序的好方法，但做得好并不容易。”1.对ELISA法的非特异性评价的数据还不完善，因此当存在非特异性反应时，往往很难解释。2.固相载体的质量总是不统一的。主要原料和制备工艺不一致，徐璐不同批次的固相载体有时本底值高，有时吸附性能差，影响试验结果。3.试剂不统一，现在处于“八仙交叉，各显神通”

8、，标准还不能统一。2 .多用途酶指示器，Thermo公司电波场多用途酶指示器，50万韩元以上，多用途酶指示器的特征，1。用色杯或微板(6，12，24，48，96，384孔微板)，测量量大。2.有200-1000 nm、紫外线可见光、荧光、偏振等，波长变化达1nm，如果是有色溶液，则可以测量吸光度。3.提供终点站检测、动力学、单孔扫描、频谱扫描等读出模式。4.分析功能已扩展。多功能酶标记物的实验应用实例，DNA/RNA定量和纯度检查Bradford /Lowry实验细胞活性/细胞毒性检查MTT分析(IC50/LD50)细菌生长分析钙流检测膜前卫检查双荧光素酶报告基因分析，多功能酶标记物的实验应用

9、，ATP检测微生物生长注意事项2。酶标记板3。操作要点，1 .注意事项，1)重复试剂盒说明，熟悉操作程序。2)样品的准确度。操作中，发色剂和终止的加成量准确，最好使用加色枪加色液，以确保颜色时吸光度的准确性。不要混用枪头。洗涤时间。一般按照说明书至少要洗5次，烘干余额。4)观察和解释吸光度结果应在15min内完成。否则液体颜色会减少。5)要测试的生物样品应放在4个冰浴中。6)发色液目前配制，要避光，低温保存。7)注意购买抗体的保存。，2 .酶表盘、酶表盘材料、水溶性抗原或抗体吸附在固相载体上，成为不溶性形态，是酶表盘测定的基本条件。很多物质，例如纤维素、交联葡聚糖、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、

10、聚乙烯和聚氯乙烯，都可以用作固相载体。但是在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板。微量反应板使用的测试剂量较小，操作方便，适合大规模应用。酶标板材料、国产聚苯乙烯微量反应板(上海塑料3厂生产)目前大量应用于ELISA测量，取得了满意的结果。但是，每个微量反应板对抗原或抗体蛋白的吸附性能有很大差异。实验表明，吸附效果似乎与塑料的类型及其表面的性质有关。特别是塑料产品在加工过程中，工艺不同或受其他因素的影响，导致吸附性能的巨大差异，甚至完全丧失吸附能力。酶标鉴定，对各产品部署使用前必须经过实验室验证。鉴定的方法和标准是用检验试剂箱检验购买的微量反应板样品，显示颜色，停止反应，然后在酶

11、表示仪中测定其O.D值。(阿尔伯特爱因斯坦、美国电视电视剧、检查箱、检查箱、检查箱、检查箱)，一般认为整个主板上两个孔之间的O.D值的误差不超过10%。如果中间孔和周围孔O.D值之间的差异太大，或者反应板的一侧与另一侧凹孔的O.D值之间的差异很大，则不合格。此外，还要确认阳性和阴性参考血清O.D值是否有明显差异。一般来说，10倍左右的差异应该是合格的。酶标记机单，双波长检测，普通酶标记机都有短波长和双波长模式，为什么呢？酶标仪为垂直光路，测量的样品液面是否水平，酶标板渗透性，孔底是否平坦等影响较大。要测量吸光度A0，请选择630nm作为基准波长。在测量波长(例如，490nm/450nm)下测量

12、样品的吸光度A，进行双波长测量后，采取两者的差异，测量结果的标准偏差小于短波长下的测量，实验误差较小。用于ELISA测量的基座(例如邻苯二胺或四甲基联苯胺)，颜色结束后630nm的吸光度值只有吸收棒(490nm/450nm)吸光度值的1%以下，因此使用双波长检测也不会影响检测灵敏度。一般酶标仪比色应首选双波长。酶标记机的工作环境，1。仪器应放置在没有强磁场和干扰电压的位置。仪器应置于噪音小于40分贝的环境中。3.为了减缓光学元件的老化，必须避免阳光直射。4.工作环境温度必须在1540%和15%之间。操作中电压必须保持稳定。为了避免水蒸气、煤烟，请清洁周围的空气。7.保持干燥、清洁、水平工作台和

13、足够的工作空间。3 .BIO-RAD模型550酶指示器运行，1 .打开电源，打开酶指示器开关。装置开始自检。Self disgonsis in progress 3。按箭头光标移动到Mode，然后设置参数。在set analysis mode(设置分析模式)中显示装置后，按enter键确认。4.选择波长测量类型。按箭头光标移动到D/S，按select键选中它，然后按enter键确认。光标按双/单、双波长选择、选择、enter确定。5 .选择过滤器波长。牙齿酶标有4个波长：1:405nm；2:450nm3:490nm4:630nm。按箭头光标移动到Filt，按select键选择它，然后按ente

14、r键确认。光标显示在Mes=#X Ref=# Y处。光标选择数字3，即490nm的测量波长时，enter牙齿确定。再次按下Next，Ref，然后按游标以选取参考波长。例如，数字4 .是630nm，enter决定。6.选择是否混合。将箭头光标按Mix键，按select键将其选中，然后按enter键确认。光标出现在yes/No处。例如，如果光标选择“否”，然后按select键选择，则指示enter不混合样例。7 .返回原始显示。set analysis中的D/S FiltMix。按enter显示set analysis的Mode。说明机器已经达到测试状态。8.打开测量盖，将酶标小心地放入测量桶中，然后合宿。9.好的酶标记物专用感光印刷纸。10.按Start键开始吸光度测定，并自动打印测量结果。11.测量完成后，取出酶板，合上盖子，关闭仪器开关和电源，盖上灰尘盖。4 .Thermo多功能酶标仪的操作，1 .打开电源，然后单击SkanIt RE for Varioskan fl