第4章_微生物营养与培养.ppt

1、第四章 微生物的营养与培养,第一节 微生物的六种营养要素 第二节 微生物的营养类型 第三节 培养基 第四节 微生物的生长与培养 第五节 影响微生物生长的主要因素 第六节 有害微生物的控制,营养(或营养作用,nutrition):是指生物体从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质,以满足其生长和繁殖需要的一种生理功能。 营养物（或营养，nutrient）:指具有营养功能的物质。,第一节 微生物的六种营养要素,微生物和动物、植物营养要素的比较,微生物有六种营养要素，即 碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水。,一、碳源 凡能提供微生物所需的碳元素（碳架）的营养源称为碳源（carbon sourc

2、e）。,微生物的碳源谱,X：指除C、H、O、N 外的任何其它一种或几种元素。,二、氮源 凡能提供微生物生长繁殖所需氮元素的营养源称为氮源(nitrogen source)。,微生物的氮源谱,三、能源（energy source） 能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辅射能。 微生物的能源可来自有机物、无机物或辐射能。,四、生长因子（growth factor） 是一类对微生物正常代谢必不可少且不能用简单的碳源或氮源自行合成的有机物，如维生素、氨基酸等。,牛肉膏 （Beef Extract，牛肉浸膏） ：是采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有

3、牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。 牛肉膏中含有多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类、肌酸、肌酸酐及维生素类等水溶性物质。该产品广泛应用于各种培养基的制备，主要作用是补充蛋白胨以及其它氮源的营养不足。一般的用量为0.3%0.5%。,蛋白胨（peptone ）：是蛋白质被酸、碱或酶水解产物，主要成分为分子量大小不等的多肽和氨基酸。是微生物培养基的主要原料，在抗生素、医药工业、发酵工业、生化制品及微生物学科等领域广泛使用，可满足微生物生长过程中的氮素营养需要。不同的微生物需要特定的氨基酸和多肽。因此，用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白（酪蛋白、肉类）和植物蛋白（豆类） 两种。,酵母膏

4、（ Yeast Extract，酵母浸膏） ：是采用新鲜酵母为原料，经酶解、自溶、分离过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有酵母自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色至浅棕色。酵母浸膏富含氨基酸、B族维生素、肽、核苷酸、微量元素等。主要作用是补充氮源和提供微生物生长的各种维生素、氨基酸及其它生长因子。一般的用量为0.2%2.0%。,五、无机盐,无机物,微量元素,大量元素,一般功能,特殊功能,细胞内一般分子成分（P.S.Ca.Mg.Fe等）,生理调节物质,渗透压的维持（Na+等）,酶的激活剂(Mg2+等),PH的稳定,化能自养菌的能源（S.Fe2+.NH4+.NO2-等）,无养呼吸时的受氢

5、体（NO3-.SO42-等）,酶的激活剂（Cu2+.Mn2+.Zn2+等）,特殊分子结构成分（Co.Mo等）,六、水,配制培养基时应用去离子水或蒸馏水，必要时用双蒸馏水。,水,结合水：不能被微生物利用,游离水：能被微生物利用,aw=p/p0,p:溶液中水的蒸汽压,p0:纯水的蒸汽压,aw ：水分活度（Water activity）,第二节 微生物的营养类型,根据微生物所需能源、碳源及供氢体不同，可将其分为以下四类:,微生物的营养类型,培养基（medium or culture medium）:是一种人工配制的适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料。专供微生物培养、分离、鉴定、研究和保存用

6、的混合营养物制品。,第三节 培养基,一、培养基的种类 （一）按对培养基成分的了解可分为 1天然培养基（complex medium） 指一些利用动物、植物、微生物体或其提取物制成的培养基。无法确切知道其中的成分。,2组合培养基（defineu medium） 各成分的量都确切知道，一般仅用于作营养、代谢、生理、生化、遗传、育种、菌种鉴定和生物测定等定量要求较高的研究工作上。 3半合成培养基（semi-defined medium）,（二）按培养基外观的物理状态来分 1固体培养基（solid medium） 凝固培养基（solidified medium） 凝固剂有琼脂和明胶，加量一般为1%2%

7、琼脂或5%12%明胶。最常用的凝固剂是琼脂。,琼脂与明胶若干特性的比较,非可逆性凝固培养基 天然固体培养基 滤膜 固体培养基可广泛用于菌种分离、鉴定、菌落计数、检验杂菌、选种、育种、菌种保藏、抗生素等生物活性物质的生物测定等。,2半固体培养基（semi-solid medium） 加0.51%的琼脂，可用于细菌的运动性观察、噬菌体效价测定等。 3液体培养基（liquid medium） 作各种生理、代谢研究及获得大量菌体之用。,（三）按培养基的用途来分,1.普通培养基:适合于大多数微生物生长繁殖的培养基。,如：营养肉汤培养基（营养琼脂培养基）: 细菌 高氏一号培养基: 放线菌 查氏培养基: 霉

8、菌 PDA培养基: 蕈菌、霉菌 麦芽汁培养基（麦芽汁琼脂培养基）: 酵母菌,2.鉴别性培养基（differential medium） 培养基中加有能与某一菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而用肉眼就能使该菌菌落与外形相似的它种菌落相区分的培养基。如糖发酵培养基、酶测定培养基、生化实验培养基等。,大肠杆菌乳糖发酵试验,3.选择性培养基（selected medium） 根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。其功能是使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选效率。如增菌培养基、富集培养基等。,4. 基础培养基 5. 孢子培养基 6. 种子培养基 7

9、. 发酵培养基,三、选用和设计培养基的原则和方法 （一）原则 1.目的明确: 2.营养协调: H2O C+能源 N源 P.S K.Mg 生长因子 3.理化适宜:PH; Eh; aw 4.经济节约:,（二）方法 1生态模拟： 肉汤、麸皮、米饭、馒头等。 2查阅文献： 据不完全统计约有1700种以上。 3精心设计: 4实验比较:,第四节 微生物的生长与培养,生长：有机体的细胞组分与结构在量方面的增加。 繁殖：由于细胞分裂而引起的个体数目的增加。 发育：在一般情况下，当环境条件适合，生长与繁殖始终是交替进行的。从生长到繁殖是一个由量变到质变的过程，这个过程就是发育。,一、测定生长繁殖的方法 （一）测

10、生长量 1直接法: 测体积； 测干重。 2间接法:比浊法；生理指标法：如：碳量、氮量、磷量、核酸、产酸、产气、产CO2、耗氧、粘度、产热等。,（二）计繁殖数 一般用于测定酵母菌或霉菌孢子悬液的浓度。 1. 直接法： 如：血球计数板法,每ml菌液酵母菌细胞数 = 每小格平均酵母细胞数40010000稀释倍数。,稀释度选择及菌落总数报告方式,菌落总数和报告方式以1g或1ml样品中的菌落形成单位个数计（用CFU/ml或g表示）,2间接法 平板菌落计数法 操作步骤：样品稀释，倒平皿，计菌落数，统计结果。,二、微生物培养 (一)纯培养 纯培养（culture）：只含有某一个特定微生物菌株的培养称为纯培养

11、。 无菌操作或无菌技术（sterile techniques）：使工作者免受他们所研究的微生物伤害和所研究的微生物培养物不受环境中其他微生物污染的方法称为无菌技术或无菌操作。,1. 划线法,获得纯培养的方法,2. 平板涂抹法,4. 单细胞分离法 5. 利用选择培养基分离,3. 稀释平皿法,（二）同步培养（synchronous culture ）,使微生物群体中的所有细胞尽可能都处于同样生长和分裂周期中的培养称为同步培养。这种通过同步培养而使细胞群体处于分裂步调一致的状态称为同步生长。,同 步 生 长 曲 线,（三）分批培养 (batch culture or closed culture),

12、单细胞微生物在液体培养基中的生长规律,特点： 生长速率常数等于零（生长速率常数R是指每小时的分裂代数）； 细胞形态变大或增长； 细胞内RNA等的含量增高； 合成代谢活跃； 对外界理化因子反映敏感。 影响因素： 菌龄； 接种量； 培养基成分等。,1延滞期（lag phase）,特点： R最大，因而细胞每分裂一次所需的时间G（generation time-世代时间，简称为“代时”）最短； 细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀； 酶系活跃代谢旺盛。 影响因素： 菌种； 营养成分； 营养物浓度。,2指数期（exponential phase）,特点： R等于零，菌体产量达到最高； 细胞开始储存糖

13、原、异染颗粒和脂肪等储藏物； 多数芽孢杆菌在这时开始形成芽孢； 有的微生物此时开始合成抗生素等次生代谢物。 稳定期到来的原因： 营养物尤其是生长限制因子的耗尽； 营养物的比例失调，如C/N比例不合适等； 酸、醇毒素或H2O2等有害代谢产物的累积； pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜等。,3稳定期（stationary phase）,特点：R为负值，细胞形态多样如膨大、不规则的退化形态，有的微生物因蛋白水解酶活力的增强就发生自溶（autolysis）；有的微生物产生或释放对人类有用的抗生素等次生代谢产物，芽孢杆菌中芽孢释放往往也发生在这一时期。,4衰亡期（death phase或declin

14、e phase）,（四）微生物的连续培养（continuous culture）,当微生物以单批培养的方式培养到指数期的后期时，一方面以一定速度连续流进新鲜培养基，并立即搅拌均匀，另一方面，利用溢流的方式，以同样的流速不断流出培养物。这样，培养物就达到动态平衡，其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和稳定的生长速率上。,（五）固定化培养,将微生物细胞包埋在特定的载体内，然后把它置于发酵液中，微生物在载体内的空隙中生长繁殖，并对基质进行发酵形成发酵产物。常用的载体有琼脂、明胶、海藻酸钠海藻酸钙等。,三、常见微生物培养方法,斜面试管培养 琼脂平板培养 试管液体培养 三角瓶液体浅层培养 摇瓶培

15、养,第五节 影响微生物生长的主要因素 影响微生物生长的因素很多，除了营养条件外，还有许多理化条件，其中最主要的有温度、pH、和氧气。 (一) 温度,微 生 的生长温度,最低生长温度：一般为 -5 -10，极端为 -30,最适生长温度,嗜冷菌： 20,中温菌：20 45,室温菌（25）,体温菌（37）,嗜热菌： 45,最高生长温度：一般 80 95，极端 105 300,最适生长温度：某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。,微生物,好氧菌,厌氧菌,专性好氧菌：在正常大气压下进行好氧呼吸产能。,兼性厌氧菌：以呼吸为主，兼营发酵产能；以呼吸为主， 兼营厌氧呼吸产能。,微 好 氧 菌：只能在较低

16、的大气压下生活。,专性厌氧菌：只能生长在无氧或基本无氧条件下，氧对其有毒害,耐氧菌：只能以发酵产能，但分子氧无毒害。,(二)氧气,氧毒害机理： 1971年McCord和Fridovich提出SOD学说，他们认为，厌氧菌因缺乏SOD，故易被生物体内极易产生的超氧阴离子自由基（O2-）而毒害致死。,O2+eO2-(.O-2),(superoxide dismutase),SOD,2O2-+2H+,H2O2+O2,过氧化氢酶,H2O+1/2O2,（一切好氧微生物）,过氧化物酶,2H2O,NADH2 NAD,（耐氧菌）,(一切好氧生物及耐氧菌),(三) pH,细菌：中性至微碱性(pH 7左右)； 放线

17、菌：偏碱性(pH 8左右)； 真菌(pH 5左右)。,微生物在其生命活动过程中，会改变外界环境的pH值如：,第六节 有害微生物的控制,一、基本概念,控制措施,彻底杀灭 - 灭菌,杀灭,部分杀灭 - 消毒,抑制,拟制霉腐微生物 - 防腐,拟制宿主体内的病原菌 - 化疗,（一）灭菌（sterilization） 采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。,（二）消毒（disinfection） 采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有 害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。,（三）防腐（antisepsis） 利用某种理化因素完全拟

18、制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。防腐的措施很多，主要有： （1）低温 （4）高渗 （2）缺氧 （5）高酸度 （3）干燥 （6）防腐剂,（四）化疗（chemotherapy） 利用具有高度选择毒力（selective toxicity，即对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒力）的化学物质来拟制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。用于化疗目的的化学物质称为化学治疗剂（chemotherapeutant）。,二、常用热力消毒与杀菌的方法,常用高温灭菌方法,干热灭菌法,火焰灼烧法,烘箱内热空气灭菌法,湿热灭菌法,常压,巴氏消毒法,LTH （low temperature holdi