第二十章蛋白质的合成

1、第二十章 蛋白质的合成 蛋白质的生物合成过程实质上也是基因表达的一个过程，它包括转录和翻译。 那么在翻译过程中就有两个关键性地问题： （1）遗传密码（碱基序列）到底是怎样决定氨基酸序列的呢？也就是说什么样的碱基序列决定什么样的氨基酸序列呢？ （2）通过什么样的方式或机制实现碱基序列到氨基酸序列的转变？,需要指出的是蛋白质的合成是一个复杂的过程，包括翻译、翻译后加工和定向输送以及正确折叠，而且到现在为止，其中的许多重要方面仍在研究之中。 真核生物蛋白质的合成，需要300多种生物大分子协同工作：核糖体RNA及结合蛋白、各种酶、各种tRNA、加工修饰酶等。,第一节 mRNA mRNA的半衰期很短,很

2、不稳定,一旦完成其使命后很快就被水解掉。 原核生物和真核生物mRNA的结构差异教大，尤其是在5端。,一、原核生物mRNA的结构 1、5端SD序列 在起始密码子AUG上游9-13个核苷酸处，有一段可与核糖体16S rRNA配对结合的、富含嘌呤的3-9个核苷酸的共同序列，一般为AGGA，此序列称SD序列。 它与核糖体小亚基内16S rRNA的3端一段富含嘧啶的序列 GAUCACCUCCUUA-OH（暂称反SD序列）互补，形成氢键。 使得结合于30S亚基上的起始tRNA能正确地定位于mRNA的起始密码子AUG。,2、原核mRNA分子，许多是多顺反子。 转译时，各个基因都有自己的SD序列、起始密码子、

3、终止密码子，分别控制其合成的起始与终止，也就是说，每个基因的翻译都是相对独立的。 如E.coli，一个7000b的mRNA编码5种与Trp合成有关的酶.,二、真核生物mRNA的结构 1、真核生物mRNA5端均具有m7GpppN帽子结构，无SD序列。 帽子结构具有增强翻译效率的作用。 若起始AUG与帽子结构间的距离太近（小于12个核苷酸），就不能有效利用这个AUG，会从下游适当的AUG起始翻译。 当距离在17-80个核苷酸之间时，离体翻译效率与距离成正比。,2、真核生物mRNA通常是单顺反子。 真核mRNA具有“第一AUG规律”，即当5端具有数个AUG时，其中只有一个AUG为主要开放阅读框架的翻

4、译起点。起始AUG具有二个特点： （1）AUG上游的 -3经常是嘌呤，尤其是A。 （2）紧跟AUG的 +4常常是G。 起始AUG邻近序列中，以ANNAUGGN的频率最高。若-3不是A，则+4必须是G。无此规律的AUG，则无起始功能。,第二节 遗传密码 我们已经知道,多肽上氨基酸的排列次序最终是由DNA上核苷酸的排列次序决定的，而直接决定多肽上氨基酸次序的是mRNA上的核苷酸的排列次序,不论是DNA还是mRNA都是由4种核苷酸构成，而组成多肽的氨基酸有20种,显然,必须是几个核苷酸的组合编码一个氨基酸才能应付局面. 每2个核苷酸编码1个氨基酸 有16中编码方式 每3个核苷酸编码1个氨基酸 有64

5、种编码方式 每4个核苷酸编码1个氨基酸 有256种编码方式 时刻记住生物体是一个最理想的体系.,而且科学家们用生物化学实验已经证实是3个碱基编码1个氨基酸,称为三联体密码或密码子。 一、遗传密码的破译 在遗传密码的破译中,美国科学家M.W.Nirenberg等人做出了重要贡献 ,并于1968年获得了诺贝尔生理医学奖.,二、遗传密码的特点 在64个密码子中有61个编码氨基酸 3个不编码任何氨基酸而起肽链合成的终止作用，称为终止密码子，它们是UAG、UAA、UGA， 密码子AUG（编码Met）又称起始密码子。 密码子：mRNA上由三个相邻的核苷酸组成一个密码子，代表肽链合成中某种氨基酸或合成的起始

6、与终止信号。,（1）方向性：从mRNA的5到3 （2）连读性 编码一个肽链的所有密码子是一个接着一个地线形排列，密码子之间既不重叠也不间隔，从起始密码子到终止密码子构成一个完整的读码框架（不包括终止子），又称开放阅读框架（ORF）。 那么如果在阅读框中插入或删除一个碱基就会使其后的读码发生移位性错误（称为移码）。 需要指出的是，两个基因之间或两个ORF之间可能会互相部分重叠（共用部分序列）。,（3）简并性 几种密码子编码一种氨基酸的现象称为密码子的简并性。 如GGN（GGA、GGU、GGG、GGC）都编码Gly，那么这4种密码子就称为Gly的简并密码。 只有Met和Trp没有简并密码。一般情况

7、下密码子的简并性只涉及第三位碱基。,问题：简并性的生物学意义？ A、可以降低由于遗传密码突变造成的灾难性后果 试想，如果每种氨基酸只有一个密码子，那么剩下的44个密码子都成了终止子，如果一旦哪个氨基酸的密码子发生了单碱基的点突变，那么极有可能造成肽链合成的过早终止。 B、可以使DNA上的碱基组成有较达的变化余地，而仍然保持多肽上氨基酸序列不变。 如GUU编码Ala，由于简并性的存在，不论第三位的U变成什么，都仍然编码Ala,（4）摇摆性 密码子中第三位碱基与反密码子第一位碱基的配对有时不一定完全遵循A-U、G-C的原则，也就是说密码子的碱基配对只有第一、二位是严谨的，第三位严谨度低，Crick

8、把这种情况称为摇摆性，有人也称摆动配对或不稳定配对。显然，密码子的第三位和反密码子的第一位是摇摆位点。 具体说来，反密码子第一位的G可以与密码子第三位的C、U配对，U可以与A、G配对，另外反密码子中还经常出现罕见的I，可以和密码子的U、C、A配对，这使得该类反密码子的阅读能力更强。,（5）通用性：密码子在不同物种间几乎是完全通用的。 目前只发现线粒体和叶绿体内有列外情况。但要注意的是不同生物往往偏爱某一种密码子。,第三节 核糖体 核糖体又称核蛋白体，它是蛋白质合成的场所 对于真核细胞来说，核糖体按其在细胞质中的位置分为游离核糖体（合成细胞质蛋白）和内质网核糖体（合成分泌蛋白和细胞器蛋白）。 不

9、论原核细胞还是真核细胞，一条mRNA可以被同时几个核糖体阅读，把同时结合并翻译同一条mRNA的多个核糖体称为多核糖体。,一、核糖体的结构与组成 核糖体是由核糖核酸（称为核糖体核酸, rRNA）和几十种蛋白质分子（核糖体蛋白）组成的一个巨大的复合体。 不同类型生物中核糖体的结构高度保守，尽管其rRNA和核糖体蛋白的一级结构有所不同，但其三级结构却惊人的相似。 核糖体的大亚基上有两个重要的位点： P位点是结合肽酰tRNA的肽酰基的位点 A位点是结合氨酰tRNA的氨酰基的位点,二、rRNA与核糖体蛋白的结构与功能 （一）rRNA的结构与功能 结构：有大量的茎环（发夹）结构，结构复杂，可能是核糖体的钢

10、筋骨架。 功能： （1）蛋白质合成的施工平台（骨架） （2）催化肽键形成的转移酶活性存在于23SrRNA上 有人小心的去掉细菌核糖体的蛋白质组分，保持rRNA的相对完整性，发现蛋白质的合成仍可进行。,（3）参与tRNA与mRNA的结合 可能的情况是：mRNA先识别rRNA的特定序列并结合固定下来,然后tRNA再识别并固定到rRNA特定的部位，其反密码子才与mRNA密码子配对。 已经知道16SrRNA上有一段序列与原核mRNA上的SD序列相结合。 （4）在大小亚基的聚合中起重要作用 （5）在翻译的校正和翻译的调控方面有重要功能（如可结合调控因子） 总的来说，RNA分子似乎是整个核糖体的活跃的活性

11、中心。,（二）核糖体蛋白的结构与功能 结构： 大多数核糖体蛋白呈纤维状（可能起骨架作用），少数呈球状（可能起生物功能）。 功能： (1)维持核糖体的结构 (2)新发现：还有些真核核糖体蛋白具有DNA修复功能,问题： 既然蛋白质是在核糖体中合成的，那么第一个核糖体中的蛋白组分又是怎样合成的？ 第一个核糖体又是怎样出现的？ 先有DNA还是先有蛋白质？,大多数科学家越来越支持RNA起源论，既然核糖体中既有蛋白质又有RNA，那么彻底搞清楚核糖体的结构与功能及其起源也许会弄清生命的起源和演化。 RNA起源论： 第一个生活细胞里出现的是RNA分子，他同时具有信息储藏和生物演化的双重特性，也就是说既可以在一

12、定程度上复制自己，又可以催化一些最初的生化反应，后来，随着活细胞的进化，DNA逐渐出现并成为更为稳定的遗传信息储存分子。,第四节 蛋白质合成的机理 游离氨基酸在掺入肽链以前必须活化以获得额外的能量，每一种游离氨基酸首须在专一的氨酰tRNA合成酶的帮助下与专一的tRNA相连（有人称装载，LOAD） 然后由tRNA负责将它带到核糖体上的特定位点（A位点上）并添加到正在合成的肽链C末端 这种从游离氨基酸到形成氨酰tRNA的过程既是氨基酸的活化过程，也是肽链每合成一步或延伸一步的必经准备阶段。,一、氨酰tRNA合成酶： 氨基酸的活化和氨酰tRNA的合成 氨酰tRNA合成酶既能识别氨基酸，又能识别tRN

13、A。 （一）活化 在Mg2+的存在下，氨酰tRNA合成酶首先识别并结合专一的配体氨基酸，然后氨基酸的羧基与细胞环境中的ATP发生反应形成一个酸酐型的高能复合物（氨酰AMP中间复合物）。该中间复合物暂时结合在酶上。,（二）连接 由于氨酰tRNA合成酶上还存在专一的tRNA识别位点，因此特定的游离tRNA就会识别并结合到氨酰AMP-酶复合物的活性部位，此时氨基酸就会被转移到tRNA的3端，其羧基与tRNA 3端的自由-OH形成氨酰酯键，从而形成氨酰tRNA，这也是一个高能化合物，其能量足以形成肽键。 由于氨酰tRNA能量低于氨酰AMP，所以这一过程是可以自发的。,氨基酸一旦与tRNA形成氨酰tRN

14、A后进一步的去向就由 tRNA来决定了，tRNA凭借自身的反密码子与mRNA上的密码子 相识别，从而把所携带的氨基酸送到肽链的 一定位置上。 每一个密码子对应的肽链位置上都能掺入正确的氨基酸。,氨酰tRNA合成酶： 每一种氨基酸都有至少一种专一的氨酰tRNA合成酶，它即能 识别氨基酸，又能识别tRNA，从而把特定的氨基酸连到对应的 tRNA上，有人也把氨酰tRNA合成酶的双向识别功能称为第二遗传 密码。 不同的氨酰tRNA合成酶在分子量、氨基酸序列、亚基组成上 差异较大。它是如何识别氨基酸的呢？仍不甚清楚。,结论： （1）氨基酸的活化和氨酰tRNA的合成是蛋白质生物合成的第一步，每一种氨基酸在

15、被掺入肽链之前都首先被活化和连接在专一tRNA上，活化和连接都发生在氨基酸的羧基上。 （2）载体tRNA凭借自身的反密码子与mRNA上的密码子相识别,而把所携带的氨基酸送到肽链的一定位置上 （3）遗传信息是通过mRNA上的密码子与tRNA上的反密码子间碱基配对作用翻译出来的 。,二、蛋白质合成的一般过程 可以分为三个阶段：起始、延伸、终止，分别由不同的起始因子、延伸因子和终止因子（释放因子）参与。 （一）翻译起始 （1）小亚基与mRNA结合 （2）起始氨酰tRNA进入P位点，它的反密码子与mRNA上的起始密码子AUG碱基配对。 （3）大亚基与小亚基结合形成起始复合物。,（二）延伸 方向：mRN

16、A 5 3 新生肽： N端 C端 （1）就位：第二个氨酰tRNA通过密码子反密码子的配对作用进入核糖体的A位点（氨基位点）。 （2）转肽：在大亚基上肽酰转移酶（peptidyl transferase）的作用下，A位点氨基酸的A-氨基亲核攻击P位点氨基酸的羧基基团并形成肽键，结果两个氨基酸均连到了A位点的tRNA上，该过程称为转肽作用（transpeptidation），此时，P位点上卸载的tRNA从核糖体上离开。 （3）移位（translocation，也可称转位）：核糖体沿着mRNA移动1个密码子位置，携带肽链的tRNA转位到P位点，A位点空出以便接纳下一个氨基酸。,（三）终止 由于终止密

17、码子不能结合任何氨酰tRNA，于是肽链合成的终止因子（又称释放因子）识别并结合到终止密码子上，接着肽转移酶的酯化酶功能转变成水解功能，将肽链从P位点tRNA上水解掉，核糖体释放掉mRNA并解体成大小亚基，翻译结束。 在翻译过程中除了核糖体大小亚基、 mRNA和氨酰tRNA外，还需要GTP和许多蛋白辅助因子。 这些辅助因子有的起催化作用，有的起改变和稳定构象作用。,（四）翻译后加工 不论原核生物还是真核生物，翻译完成后，一些肽链能直接折叠成最终的活性形式，不需要加工修饰，然而经常的情况是新生肽链需要加工修饰（称为翻译后加工或修饰）包括： （1）切除部分肽段（蛋白酶） （2）在特定氨基酸残基的侧链

18、上添加一些基团（共价修饰） （3）插入辅因子，还有些单肽要聚合成多亚基蛋白。,翻译后加工有两方面目的： （1）功能需要 （2）定向转运的需要（这在真核生物中尤为复杂，合成的蛋白要定向运输到细胞质、质膜、各种细胞器如叶绿体、线粒体、溶酶体、过氧化物酶体等）。 尽管原核生物与真核生物在蛋白质合成方面有许多相似之处，但也存在差异，这些差异正是一些抗生素治疗和研究应用的基础。,三、原核生物的蛋白质合成 原核生物（大肠杆菌）每秒钟可翻译20个氨基酸，比真核生物快得多，而真核生物每分钟才大约50个氨基酸。 （一）翻译起始 翻译是从形成起始复合物开始的，在原核生物中该过程需要三个起始因子参与：IF1，IF2

19、，和IF3。（IF1的功能尚不清楚）。 （1）IF3首先结合在30S亚基上，防止它过早地与50S亚基结合。,（2）mRNA结合到30S亚基上。 原核mRNA上在距起始密码子上游约10bp处有一段很短的（约10bp）富含嘌呤的区域称为SD序列，它能与30S亚基上的16S rRNA 3端的一段互补序列（不妨称反SD序列）配对结合，mRNA正是通过其SD序列与16S rRNA的配对结合而使它处于核糖体上的恰当的位置，并使起始密码子AUG处于P位点。 SD序列与16S rRNA的配对还为识别起始密码子和Met密码子提供了一种机制。 原核多顺反子mRNA上的每一个基因都有自己的SD序列、起始密码子和终止

20、密码子，每一个基因的翻译都是相对独立的。,（3）IF2 、fMet-tRNAfmet结合到30S亚基上 IF2是一个GTP结合蛋白，它先与30S亚基结合并促使起始氨酰tRNA的密码子与mRNA 上的AUG结合（P位点）。 原核生物的起始氨酰tRNA是N甲酰甲硫氨酰tRNA（fMet-tRNAfmet ）。,（4）50S大亚基结合到30S小亚基上，形成起始复合物。 GTP水解成GDP释放的能量引起30S亚基构象变化，50S亚基结合到30S亚基上，同时IF2和IF3释放。 因此，原核生物肽链合成的起始复合体由mRNA、70S核糖体、fMet-tRNAfMet组成,（二）延伸 肽链延伸分三步进行：

21、（1）新的氨酰tRNA进入核糖体的A位点； （2）肽键形成（转肽）； （3）核糖体移位（转位）。 这三步构成了肽链延伸的一个循环。,1、新氨酰tRNA入位 首先，在进入A位点之前，新氨酰tRNA必须与延伸因子EFTuGTP结合。延伸因子EFTu是一个GTP结合蛋白，参与氨酰RNA的就位。 氨酰RNA就位后，EFTuGTP水解，EFTuGDP从核糖体上释放下来 在第二个延伸因子EFTs帮助下EFTuGDP释放掉GDP并重新结合一分子GTP再生成EFTuGTP。,2、肽键形成（转肽） 肽键是在肽酰转移酶催化下形成的，现在认为肽酰转移酶活性存在于50S亚基23S rRNA上。驱动肽键形成的能量由P位

22、点上的氨基酸与它的tRNA的高能肽酰酯键提供。新肽键形成后P位点卸载的tRNA就离开核糖体。 3、核糖体移位。 移位需要另一个GTP结合蛋白EFG（延伸因子，又叫移位酶）的参与。现在认为，GTP水解成GDP时释放出的能量促使核糖体构象发生变化，驱动肽酰tRNA从位点移动到位点。空下的位点等待接纳下一个氨酰tRNA 。,（三）终止 当终止密码子（UAA, UAG,UGA）进入位点时肽链合成就进入终止期。 原核生物有三个释放因子（RF-1, RF-2, RF-3）参与终止。 RF1识别UAA和UAG，RF2识别UAA与UGA, RF3作用尚不清楚，可能促进RF1与RF2结合。 这种识别过程需要GT

23、P并改变了核糖体的构象，肽酰转移酶的功能发生瞬时变化，转变成酯酶功能，将连接肽链与P位点tRNA的肽酰酯键水解开，肽链从核糖体上释放，mRNA与tRNA解离，核糖体解体。,原核生物蛋白质合成中的能量计算（合成一个二肽）,合成二肽（形成一个肽链）需8个高能键，其后每加一个a.a需4个高能键。 例：合成200个a.a残基的多肽 8+1984=800 4n=4200=800,（四）原核生物的翻译后加工 一些新生肽链从核糖体上释放下来后就直接折叠成最终的三维结构。 但多数情况下是新生肽要经过一系列的加工修饰，才具有功能。 有关翻译后加工修饰的许多信息都来自真核生物中的研究，但是原核细胞中的多肽也要经过几种类型的共价修饰。,1、切除加工 包括去掉N端的甲酰甲硫氨酸和信号肽序列。 信号肽（Signal peptide），也叫引导肽（leader peptide），是决定多肽最终去向的一段序列，