植物DNA的提取.ppt

1、植物DNA的提取及凝胶电泳分析,学生：潘园园 指导老师：王慧中 应奇才,实验目的,了解真核生物基因组DNA提取的原理。 掌握CTAB法提取植物基因组DNA及琼脂糖凝胶电泳的方法。,1、植物DNA提取 非离子型去污剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）可以溶解细胞膜，并能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸复合物与蛋白以及多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，使之形成纤维状絮团，CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去，离心沉淀收集得到DNA。,实验原理,实验原理,

2、2、凝胶电泳分析 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶是分离和纯化DNA片段的标准方法。 聚丙烯酰胺凝胶电泳适用于分离小分子的核酸；琼脂糖凝胶孔径较大，应用于大分子核酸的分离和纯化，分离大小范围在0.2-50kb的DNA片段。 用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶（ethidium bromide ,EB）染色，溴化乙锭嵌入碱基对之间形成荧光络合物，在紫外线激发下发出红色荧光。,实验原理,在紫外光下至少可以检测出110ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。 在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比。观察其迁移距离，与标准DNA片段进行对照，就可获知该样品分子

3、量大小。,实验材料和试剂,实验材料 新鲜烟草叶片 实验试剂 2CTAB缓冲液 氯仿/异戊醇（24：1） 液氮 70%乙醇 异丙醇 TAE缓冲液 6DNA凝胶上样缓冲液 琼脂糖 溴化乙锭（EB） 标准分子量DNA,实验步骤,CTAB法提取植物总DNA 1、取2cm新鲜烟草叶片于研钵中，加入液氮研磨，研磨成碎粉状。 2、迅速转移到1.5ml离心管中,加入了600 l 2CTAB提取液（65预热） ，缓慢振荡30s。放入65振荡水浴锅中4060 min。 3、加入等体积氯仿/异戊醇，缓慢颠倒混匀至无明显分层，室温静止12min。室温下10000r/min离心10min。 4、取500 l上清液，加入

4、2/3体积的异丙醇，缓慢颠倒混匀，絮状沉淀为DNA，-20放置1h。 5、12000r/min离心10min，去上清，加入200l 70%乙醇洗涤。 6、12000r/min离心5min，去乙醇，风干。 7、用30 l TE或者双蒸水溶解DNA，取5l 电泳，剩余-20保存备用。,实验步骤,琼脂糖凝胶电泳 1、稀释缓冲液的制备 用50 TAE配置成1 TAE稀释缓冲液，待用。 2、胶液的制备 称取1g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入100ml 1TAE，即1%琼脂糖凝胶。放入微波炉（或电炉）上加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀。 3、胶板的制备 向冷却至4050的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭（EB

5、）溶液，使其终浓度为0.5g/ml，将凝胶倒入胶槽里，注意不要有气泡。,实验步骤,4、加样 取5 l提取的植物DNA溶液与1l 溴粉蓝液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。 5、电泳 加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。保持电压在80110V，电流在40 mA以上。 6.、观察和拍照 在波长为254nm的长波长紫外灯下电泳胶，并拍照保存。,注意事项,1、液氮研磨时，应当快速转移，降低DNA的降解。 2、CTAB裂解液要预热，以抑制Dnase，加速蛋白变性，促进DNA溶解。 3、各操作步骤要轻柔，尽量减少机械外力造成DNA降解。 4、取上清时，不应贪多，以防非核酸类成分干扰。 5、异丙醇要预冷，以减少DNA的降解，促进DNA与蛋白等得分相及DNA沉淀。 6、溴化乙锭EB是强诱变剂