ELISPOT方法幻灯.ppt

1、一、ELISPOT检测细胞因子实验技术,ELISPOT检测方法特点,通过两种高亲和力的特异性抗细胞因子抗体来检测淋巴细胞分泌细胞因子情况 在分泌细胞原处捕获该细胞分泌的细胞因子 斑点的生成属于一种显色反应：SPOT=细胞印迹 斑点可持久保存并进行计数分析,可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力 计数特异性抗原刺激下分泌性淋巴细胞产生的比例 有效、快速、灵敏度高 使用高吸附性的专用ELISPOT培养板 细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰 比传统的ELISA和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍 易操作 样本量大的情况下实验结果可用计算机图象分析系统进行快速、客观的分析,106抗原呈

2、递细胞（APC）中混入特定数量的IFN-+的T淋巴细胞 ，经下列方法检测： ELISPOT 细胞内细胞因子染色（FACS） ELISA,X坐标： 106 APC中实际IFN-+T细胞数量 Y坐标： 各检测方法的检测结果,ELISPOT/FACS/ELISA 检测精确度比较,Coating Ab 包被培养孔并经BSA阻断,根据实验设计加入淋巴细胞及含或不含刺激因子的培养液孵育,基 本 原 理,活化的淋巴细胞可分泌细胞因子与Coating Ab结合,洗除细胞，依次加入生物素标记的抗细胞因子抗体及酶标抗生物素抗体进行反应,加入酶底物显色形成斑点（SPOT）,B细胞杂交瘤的筛选 化合物和药物免疫学反应

3、的检测 优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性 靶向疫苗的质控 自身免疫疾病的诊断和预后分析 自身免疫疾病免疫治疗的监控 过敏性疾病的脱敏治疗的监测 器官移植中排斥反应的预测 微量组织、肿瘤和免疫细胞分泌谱的分析 结核病的诊断,ELISPOT方法主要用途,P=0.0213,Distribution of MHC mismatched renal transplant patients per frequency of IFN-gamma producing allopetide reactive T Cells,Najafian N, Salama A, Illigens BW, et.al BRI

4、GHAM AND WOMENS HOSPITAL CHILDRENS HOSPITAL HARVARD MEDICAL SCHOOL BOSTON, MA,Minor-mismatched Allograft,Major-mismatched Allograft,0,250,500,750,Spots,IFN- gamma producing Cells in minor vs. major-mismatched WT Allograft Recipients on Day 14,PubMed搜索关键词immunospot或ELISPOT或ELISA-Spot所得历年文献数目,猴ELISPOT

5、细胞因子检测流程示意图,Coating Ab 包被培养板,0.05%PBS-Tween20(PBST) 洗板5次,每孔加入1%BSA阻断,按实验设计 加入含或不含刺激剂的培养液 及一定数目细胞孵育5-24小时,40C过夜,370C孵育1小时,取外周血单核细胞 或脾淋巴细胞 根据实验要求， 培养液中加入 所需刺激物， 预先将所检测细胞 孵育24-42小时,无菌,直接取外周血 单核细胞或 脾淋巴细胞,或者,去除细胞，加入冰冻去离子水200ul/孔， 培养板置冰上10分钟,加入生物素标记 的detector Ab,加入酶标抗生物素抗体(GABA),40C暗处混合显色剂I和II, 加入显色剂I/II,

6、 暗处室温孵育20-30分钟,PBST洗板10次,370C孵育1小时后，PBST洗板5次,370C孵育1小时后，PBST洗板5次,显微镜下观察至斑点形成， 去离子水清洗培养板 室温干燥后 在倒置显微镜下观察结果,非无菌,技 术 要 点,预孵育的淋巴细胞若有坏死/凋亡（培养液过黄）会影响斑点的形成 提取淋巴细胞时应尽量去除红细胞的干扰 入ELISPOT培养孔的细胞须为单细胞悬液 细胞孵育过程应保证ELISPOT培养板静置，CO2培养箱应保证稳定，避免震荡 稀释抗体及GABA冻干粉时建议无菌操作，保存过程避免细菌的污染以保证其效用 显色剂I和II应避光保存，不使用时切勿混合,ELISPOT实验技术

7、广泛应用的主要原因之一就在于,酶联斑点自动图象分析仪（ELISPOT READER） 及相应图象分析软件的出现,Bioreader 3000TM PRO 酶联斑点自动图象分析仪,适用于分析： 酶联斑点(Elispot) 克隆形成（CFU） 病毒斑（Viral Plaque）,德国Biosys公司产品,原 理 示 意 图,增强培养板上斑点成像对比度 有效抑制因板孔侧壁反光造成的“幻影现象”，准确识别微孔边沿处斑点。,专利3D双照明系统,培养孔边沿识别功能,选定培养板参数 设定Border Offset数值,Border Offset数值一般为3-10mm3,漂洗功能（WASH OUT）,ELISPOT原始图象（显微镜下）,Bioreader优化图象,Bioreader结果分析图象,可进行背景的优化和补偿,局部背景校正度、wash out背景补偿水平等参数可由用户根据需要设定,斑点光密度(Optical Density)分析及融合斑点的自动分离,4种形态测定参数,用户可根据需要设定参数上下限，保证检测的精确度,完善的实验结果输出系统,专业报告包括